Analizzando la dinamica delle proteine ​​che utilizzano l'idrogeno Scambio Spettrometria di Massa

Summary

Proteine ​​conformazione e la dinamica sono la chiave per comprendere il rapporto tra struttura e funzione delle proteine. Scambio idrogeno accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione è un metodo versatile per studiare le dinamiche conformazionali di proteine ​​e caratterizzazione della proteina-ligando e proteina-proteina interazioni, comprese le interfacce di contatto ed effetti allosterici.

Abstract

Tutti i processi cellulari dipendono dalla funzionalità delle proteine. Sebbene la funzionalità di una data proteina è la diretta conseguenza della sua sequenza amminoacidica unico, si realizza solo dal ripiegamento della catena polipeptidica in un'unica disposizione tridimensionale definito o più comunemente in un insieme di conformazioni interconversione. Indagare il rapporto tra proteine ​​conformazione e la sua funzione è quindi essenziale per una comprensione completa di come le proteine ​​sono in grado di adempiere al loro grande varietà di compiti. Una possibilità per studiare i cambiamenti conformazionali una proteina subisce mentre procede attraverso il suo ciclo funzionale è idrogeno ^H-1/2 H-scambio in combinazione con spettrometria di massa ad alta risoluzione (HX-MS). HX-MS è un metodo versatile e robusto che aggiunge una nuova dimensione alle informazioni sulla struttura ottenuta per esempio cristallografia. E 'utilizzato per lo studio delle proteine ​​piegatura e dispiegamento, legame di piccole molligandi ecule, interazioni proteina-proteina, cambiamenti conformazionali legati alla catalisi enzimatica, e allosteria. Inoltre, HX-MS è spesso utilizzato quando la quantità di proteina è molto limitata o cristallizzazione della proteina non è fattibile. Qui forniamo un protocollo generale per studiare la dinamica delle proteine ​​con HX-MS e descriviamo un esempio di come rivelare l'interfaccia interazione di due proteine ​​in un complesso.

Introduction

Il numero di strutture cristalline di proteine ​​e complessi proteici aumentato rapidamente negli ultimi anni. Essi presentano inestimabili istantanee della organizzazione strutturale di queste proteine ​​e forniscono una base per l'analisi struttura-funzione. Tuttavia, la dinamica delle proteine ​​e dei cambiamenti conformazionali, che sono essenziali per le loro funzioni, sono raramente rivelate da cristallografia a raggi X. Crio-electronmicroscopy, invece, è in grado di catturare proteina e proteina complessi in differenti conformazioni ma generalmente non possono risolvere cambiamenti conformazionali fino a livello di struttura secondaria ^1. Dinamica conformazionale delle proteine ​​in soluzione a dettagli atomiche possono essere risolti solo da NMR, ma questo metodo è ancora limitato alle proteine ​​di relativamente piccole dimensioni (generalmente ≤ 30 kDa) e ha bisogno di alte concentrazioni di proteine ​​(≥ 100 micron), che ostacola gli esperimenti con oligomerizzazione o aggregazione di proteine ​​incline ^2. Un metodo cheè in grado di colmare tra l'alta risoluzione cristallografia a raggi X e crio-electronmicroscopy e che non è limitata dalla dimensione proteine ​​o concentrazione è ammide ^idrogeno-1 H / ² H-scambio (HX) in combinazione con spettrometria di massa (MS). Negli ultimi anni questo metodo è sviluppata per uno strumento analitico che per l'analisi della dinamica delle proteine, folding, la stabilità della proteina e cambiamenti conformazionali ^3-5. La base molecolare di questo metodo è la natura labile di backbone idrogeni ammidici in proteine, che si scambieranno con atomi di deuterio quando la proteina viene posto in un D ₂ O soluzione. Il conseguente aumento della massa proteica nel tempo viene misurata con alta risoluzione MS.

In brevi peptidi strutturati HX dipende solo dalla temperatura, concentrazione di catalizzatore (OH ^-, H ₃ O ⁺ pH, vedi Figura 3) e catene laterali di aminoacidi residui adiacenti a causa induttiva, gattoeffetti alytic e sterici. Questi effetti sul intrinseca scambio chimico tasso k _ch sono state elegantemente quantificata Bai et al. ⁶ e un programma è disponibile (cortesia Z. Zhang), che calcola k _ch per ogni amminoacido in un polipeptide dipende dal pH e temperatura. A pH neutro e temperature ambiente k _ch è dell'ordine di 10 ¹ -10 ³ sec ^-1. Nelle proteine ​​ripiegate HX può essere 2-9 ordini di grandezza più lento dovuto principalmente legame idrogeno nella struttura secondaria e in misura minore a causa di accesso ristretto di idrati ioni OH ^– all'interno di una proteina strettamente ripiegata. HX in proteine ​​native implica quindi dispiegarsi, a scambio chimico parziale o globale e ripiegamento allo stato nativo secondo l'equazione (1) e ai tassi di cambio osservati k _obs dipendono _op tasso di apertura k, il tasso di chiusura k _cl e lo scambio chimico intrinseco raTE k _ch secondo l'equazione (2).

In condizioni di stato nativo k _op è molto più piccolo di k _ch e può essere trascurato nel denominatore. Ci sono due regimi di cambio estreme chiamati EX1 ed EX2. Se k _cl è molto più piccolo k _ch (EX1) il tasso osservato è praticamente uguale al tasso di apertura e HX permette l'osservazione immediato dello svolgimento di un elemento strutturale. Un tale regime di scambio, dove ogni scambio contemporaneamente protoni ammidici all'apertura dell'elemento strutturale, è facilmente osservabile in MS da una distribuzione bimodale dei picchi isotopici ^7. Se k _cl è molto maggiore di k _ch (EX2) il tasso osservato è proporzionale k _ch cui la costante di proporzionalità è uguale equilibri-piegatori dispiegarsi costante K _u = k _op </sub> / K _cl. In queste condizioni, molti eventi di apertura e chiusura sono necessarie prima di effettuare cambi protoni ammidici per deuteroni, portando ad un graduale aumento della massa media mentre la distribuzione isotopica rimane sostanzialmente identico. Il regime EX2 consente la determinazione dell'energia libera di dispiegarsi ΔG _u e quindi la stabilità di un elemento strutturale. In condizioni stato nativo il regime EX2 è più comune. Aumento del pH e aggiunta di agenti caotropici può spostare il meccanismo di scambio di EX1. Pertanto, HX-MS può essere utilizzato per esplorare termodinamico e parametri cinetici di folding e cambiamenti conformazionali.

Come accennato in precedenza HX è intrinsecamente pH e temperatura dipendente e lo scambio emivita di un protone completamente solvente esposta del gruppo ammidico backbone è tra 5-400 msec a pH fisiologico (pH 7,6) e 30 ° C, ma 10 min a> 15 ore con una media di> 2 ore a pH 2,9 e 0 °C (tranne per il protone del primo backbone ammide legame di un polipeptide, che scambia con un'emivita di ca. 1-2 min). In tali condizioni lento scambio è possibile digerire l'esempio utilizzando proteasi (ad esempio pepsina) che sono attivi in queste condizioni, con fuori perdere tutte le informazioni contenute nei deuteroni incorporati. Dopo l'introduzione di digestione peptica in condizioni scambio lento, non solo la cinetica complessiva HX di proteine ​​integrali possono essere analizzati ma HX possono essere localizzati alle regioni specifiche ^8,9. Risoluzione spaziale è attualmente limitata alle dimensioni dei frammenti generati peptiche, che è in generale tra 10-30 residui. Tuttavia, frammenti sovrapposti creati a causa della natura non specifica di clivaggio con la pepsina potrebbe portare ad un aumento della risoluzione spaziale. Inoltre, diverse altre proteasi sono risultati essere attiva in condizioni di tempra, tuttavia, molto meno efficiente rispetto pepsina ^10. Ulteriore Increase di risoluzione spaziale può essere raggiunto con la frammentazione dei peptidi in fase gassosa con metodi che conservano il modello deuterazione come cattura di elettroni dissociazione (ECD), il trasferimento di elettroni dissociazione (ETD) e infrarossi multiphoton dissociazione (IRMPD) ^11-13. Queste tecniche prevenire la perdita di risoluzione spaziale dovuta alla migrazione intramolecolare protone ("scrambling"), che si osserva per dissociazione indotta da collisione (CID) la frammentazione tecnica più comunemente usata. Tuttavia, questi metodi richiedono l'ottimizzazione per ogni singolo peptide ed è quindi ancora molto impegnativo.

HX-MS è stato utilizzato per analizzare proteina-ligando e proteina-proteina interazioni compresi l'assemblaggio del capside virale ^14-17. Proteine ​​dispiegamento e ripiegamento, nonché di temperatura indotti cambiamenti conformazionali sono stati studiati ^7,18,19. Fosforilazione e singolo aminoacido mutazione legata conformazionale cambiamenti ^16,20 e nucleotcambiamenti ide-indotti sono stati analizzati ^21,22. Pertanto, questo metodo sembra idealmente adatto per analizzare il montaggio e dinamica di macchine molecolari. Un candidato attraente, il cui meccanismo è di grande interesse generale, è il complesso chaperone Hsp90.

Protocol

1. Preparazione di tamponi e di proteine ​​Campioni Preparare H 2 O buffer. Tampone standard uso Hsp90 (40 mM HEPES / KOH, pH 7.5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl 2, 10% glicerolo) e H 2 O buffer. Nota: Se il campione è stato dializzato prima dell'analisi, utilizzare il buffer di dialisi come H 2 O buffer. È essenziale che l'O tampone D 2 differisce dalla H 2 O tampone solo in isotopo dell'idrogeno. Tamponi volati…

Representative Results

Hsp90 è un chaperon molecolare nel lievito e membro della famiglia chaperone Hsp90. Passando attraverso un ciclo di ATPasi complesso si assiste fasi tardive di piegatura di molti clienti di proteine. Pieghevole efficiente richiede il trasferimento di clienti da Hsp70 e l'interazione del Sti1/Hop co-chaperone. Sti1 lega direttamente alla Hsp90 e facilita client vincolante inibizione della ATPasi attività di Hsp90. L'interazione di Hsp90 con Sti1 è stata recentemente studiata utilizzando HX-MS 23. Pr…

Discussion

Il legame di un partner di interazione di una proteina provoca inevitabilmente variazioni di accessibilità al solvente sul sito di legame. Inoltre, molte proteine ​​subiscono cambiamenti conformazionali dinamici su vincolante, che colpiscono altre regioni oltre l'interfaccia reale di rilegatura. HX-MS è un metodo affidabile per monitorare questi cambiamenti ed è ancora capace di rivelare cambiamenti conformazionali nelle proteine ​​in tempi che gli altri metodi non possono coprire.

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Materials

Reagent/Equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
maXis QTOF	Bruker
nanoAcquity UPLC	Waters Corp.
Shimadzu 10AD-VP	Shimadzu
6-port Valve EPC6W with microelectric actuator	Valco	#EPC6W
Injection valve (manual)	Rheodyne	#7725
Poros AL20 media	Applied Biosystems	#1-6029-06
Poros R2	Applied Biosystems	#1-1118-02
Pepsin	Sigma	#P6887	use fresh pepsin
Microbore (1 mm)	IDEX	#C-128
Microbore (2 mm)	IDEX	#C-130B
Acquity UPLC BEH C8 Column	Waters Corp.	#186002876
Thermomixer	Eppendorf	#5355000.011
Tubing (various diameters)	IDEX
Fittings	IDEX	#PK-110 with PK-100