عالية الإنتاجية إبر دقيقة جدا لقنفذ البحر بيضات ملقحة
Summary
حقن مكروي هو أسلوب شائع يستخدم لتقديم بنيات الحمض النووي، mRNAs و، أليغنوكليوتيد] morpholino بواسطة العقاقير أو العلاجات الأخرى في البيض والأجنة، وخلايا الأنواع المختلفة.
Abstract
حقن مكروي إلى خلايا الأجنة وهو أسلوب شائع يستخدم لدراسة مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية. في هذه الطريقة يتم تحميل كمية صغيرة من محلول معالجة في إبرة حقن مكروي الذي يستخدم لحقن الخلايا جسديا يجمد الفردية أو الأجنة. على الرغم من الحاجة إلى التدريب الأولي لتنفيذ هذا الإجراء للتسليم الإنتاجية العالية، حقن مكروي يوفر أقصى قدر من الكفاءة والتسليم استنساخه من مجموعة واسعة من حلول معالجة (بما في ذلك مخاليط معقدة من عينات) في الخلايا، والبيض أو الأجنة. وتشمل التطبيقات لإبر دقيقة جدا تسليم بنيات الحمض النووي، mRNAs و، البروتينات المؤتلف، وزيادة وظيفة، وفقدان وظيفة الكواشف. يتم إضافة صبغة الفلورسنت أو اللونية في حل حقن لتمكين التصور لحظة من التنفيذ الفعال وكذلك أداة للتطبيع موثوق لمبلغ من الحل تسليمها. الطريقة الموصوفة تمكن Microinjection من 100-400 البحر قنفذ ضygotes في غضون 10-15 دقيقة.
Introduction
كفاءة وقابلة للتكرار تقديم العلاج هي واحدة من التحديات المنهجية الرئيسية للباحثين. وقد وضعت عدة طرق لتقديم حلول عابر العلاج في البيض والأجنة، والخلايا. وتشمل هذه الأساليب التثقيب الكهربائي (على أساس توليد المسام عابرة في غشاء باستخدام النبضات الكهربائية قصيرة) 1،2، lipofection (تسليم من خلال مزيج من الجسيمات الشحمية التي تحتوي على العلاج مع الغشاء) 1، وعجلت microparticle القصف 1 (DNA على ميكرون الجسيمات الحجم المعدنية التي تستخدم بعد ذلك لاختراق الخلايا بسرعة عالية)، وتنبيغ (يتم استخدام فيروس كوسيلة إيصال الجينات المحورة). في هذه اللحظة، حقن مكروي هو النهج الوحيد الذي يحمل ميزة تقديم أي حل مع كفاءة 100٪ مع الحد الأدنى من الكواشف. علاوة على ذلك، حل حقنة واحدة يمكن أن تتكون من مزيج معقد من العلاجات. وقد استخدمت هذه التقنية لنجاحmicroinject لاي البيض والأجنة من العديد من الأنواع مثل قنافذ البحر 3،4، حمار وحشي الأسماك 5، 6 الماوس، الضفدع 7، 8 والماشية وكذلك الخلايا واحد في زراعة الأنسجة 9. كما تم إجراء الحقن عن Blastomeres واحد في وقت لاحق من مراحل النمو 10-12.
وتستند الأساليب الحالية للإبر دقيقة جدا في طريقة ضغط الحقن التي تم وصفها في البداية من قبل Hiramoto 10، ولكن تم إحراز تقدم كبير نحو تعظيم الاستفادة من هذه العملية. وقد وصفت تقنيات Microinjection ممتازة في أماكن أخرى 11، وهنا نحن تصف إحدى الطرق المحددة التي يتم استخدامها حاليا لmicroinject قنفذ البحر (Strongylocentrotus purpuratus) البويضات المخصبة حديثا. لأكثر من قرن، كانت قنافذ البحر على قيمة تجريبية نموذج 15،16. ترتبط قنافذ البحر تطويريا ارتباطا وثيقا الحبليات (بما في ذلك لنا) وتحليلكشفت الجينوم الخاصة التي تحتوي عليها جميع الأسر الجينات الرئيسية مثل 17 الإنسان. أنها تنتج عدد كبير من الأجنة النامية بشكل متزامن الشفافة التي يمكن التلاعب بها بسهولة. باستخدام قنفذ البحر باعتباره النموذج الحي، وقد ساهم المجتمع قنفذ البحر في فهمنا لعملية الإخصاب 18-21، 22-24 خلية العمليات البيولوجية، والشبكات التنظيمية الجينات (GRNs) 25-28.
حقن مكروي إلى بيضات ملقحة قنفذ البحر يتطلب عدة خطوات. أولا، تحتاج البيض إلى أن يجمد قبل الحقن (موضح أدناه). والمغلفة أطباق حقن مكروي مع بروتامين سلفات (PS)، مما يخلق سطح موجبة الشحنة، التي يمكن أن البيض سالبة الشحنة الالتزام 3. وdejellied البيض قبل الحضانة في مياه البحر الحمضية (الرقم الهيدروجيني 5.15) لمدة 10 دقيقة، تليها اثنين يغسل في مياه البحر الطبيعية أو مياه البحر الاصطناعي (درجة الحموضة 8.0). والتجديف بعناية البيض dejellied في خط مستقيمفي منتصف الطبق PS المغلفة في وجود 1 ملم 3 aminotriazole (3-AT)، وهو مطلوب لتمنع نشاط ovoperoxidase الذي يفرز من حبيبات القشرية من البيض نتيجة للإخصاب 29. هذه الخطوة مهمة لمنع تصلب المغلف الإخصاب وتسهيل دخول إبرة حقن مكروي. كبديل ل1 ملم 3-AT، 10 ملم حمض البارامينوبنزويك (PABA) يمكن استخدامها. يتم تحميل الحل في حقن إبرة حقن مكروي باستخدام المتخصصة microloading ماصة غيض وتركيبه على حامل تعلق على مياداة مجهرية وحدة الضغط (الشكل 1). كل إبرة يمكن استخدامها لmicroinject بيضات ملقحة الفردية في تجارب متعددة في أيام منفصلة. حقن مكروي لا يمكن أن يؤديها لمدة 10-15 دقيقة حتى تتصلب بيضات ملقحة. ثم يتم غسلها بيضات ملقحة مع مياه البحر ومثقف في 15 درجة مئوية. عندما تصل الأجنة الفقس الأريمة المرحلة، التي يطلقون الانزيم الذي يساعد على هضم الفقس مكونات فرtilization المغلف 30 والسماح لهم لفصل بطبيعة الحال من الطبق PS المغلفة. إذا لزم الأمر، ويمكن فصل الأجنة برفق من الطبق باستخدام ماصة باستور ماصة الفم أو عن طريق النفخ بلطف مياه البحر على الأجنة. الطريقة الموصوفة تمكن حقن مكروي فعالة وموثوق بها من 100-400 البويضات المخصبة حديثا على طبق واحد، وتوفير وسيلة الإنتاجية العالية لتحليل المصب.
Protocol
Representative Results
Discussion
حقن مكروي هي تقنية قوية لتقديم علاجات مختلفة مثل الحمض النووي، ومرنا، والبروتينات المؤتلف، وفقدان وظيفة وربح من الكواشف وظيفة، والأصباغ ومجموعاتها في البيض والأجنة، وخلايا الكائنات الحية المختلفة 1-7. ومع ذلك، يجب أن تبقى العديد من الاعتبارات في الحسبان عند ت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر سانتياغو سواريز لقراءة نقدية للمخطوطة وبيتي Cowgill للحصول على مساعدات في التصوير الفوتوغرافي. كما نشكر المراجعين المجهول لملاحظاتهم حرجة. ويدعم هذا العمل من قبل صندوق أبحاث جامعة ولاية ديلاوير.
Materials
| Glass pasteur pipettes | VWR | 14673-043 | |
| Inverted microscope Axiovert 40C | Zeiss | 4109431007990000 | Injection microscope |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | Load injection solution |
| Nylon filter mesh 80 μm | Amazon.com | 03-80-37 | Filter eggs to get rid of debris |
| P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips | Fisher Scientific | 02707432 or 02707430 | Part of a mouth pipette |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13 374 12 | Part of a mouth pipette |
| Polyethylene tubing | Intramedic | PE-160 | Part of a mouth pipette |
| Protamine sulfate | MP Biomedicals, LLC | 194729 | Attach dejellied eggs to injection dishes |
| Sea urchins S. purpuratus | Pt. Loma Marine Invertebrate Lab | N/A | |
| Sea water | any pet store | Instant Ocean | |
| Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | Injection dishes |
| Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1 | Narishige | 9124 | Manipulate injection needle |
| Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND | Narishige | 9212 | Manipulate injection needle |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Vertical needle puller | Narishige | PC-10 | Pull injection needles |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys.Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Peng, H., Wu, Y. Y., Zhang, Y. Efficient Delivery of DNA and Morpholinos into Mouse Preimplantation Embryos by Electroporation. Plos One. 7, 13 (2012).
- Ettensohn, C. A., Wray, G. A., Wessel, G. M. . eds. Development of sea urchins, ascidians, and other invertebrate deuterostomes: experimental approaches. 74, (2004).
- Franks, R. R., Houghevans, B. R., Britten, R. J., Davidson, E. H. Direct introduction of cloned DNA into the sea urchin zygote nucleus, and fate of injected DNA. Development. 102, 287-299 (1988).
- Kinsey, W. H. Analysis of signaling pathways in zebrafish development by microinjection. Methods Mol. Biol. 518, 67-76 (2009).
- Kola, I., Sumarsono, S. H. Microinjection of in vitro transcribed RNA and antisense oligonucleotides in mouse oocytes and early embryos to study the gain- and loss-of-function of genes. Mol. Biotechnol. 6, 191-199 (1996).
- Mishina, T., Fuchimukai, K., Igarashi, K., Tashiro, K., Shiokawa, K. Modification of secondary head-forming activity of microinjected a dagger beta-catenin mRNA by co-injected spermine and spermidine in Xenopus early embryos. Amino Acids. 42, 791-801 (2012).
- O’Meara, C. M., et al. Gene silencing in bovine zygotes: siRNA transfection versus microinjection. Reprod. Fertil. Dev. 23, 534-543 (2011).
- Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. Nonviral gene delivery. Cold Spring Harb. Protoc. , (2011).
- Hiramoto, Y. Cell division without mitotic apparatus in sea urchin eggs. Exp. Cell Res. 11, 630-636 (1956).
- Wilson, L. . Methods in Cell Biology. 25, (1982).
- Gross, J. M., McClay, D. R. The role of Brachyury (T) during gastrulation movements in the sea urchin Lytechinus variegatus. Dev. Biol. 239, 132-147 (2001).
- Yajima M, W. G. Autonomy in specification of primordial germ cells and their passive translocation in the sea urchin. Development. 139, 3786-3794 (2012).
- Duboc, V., et al. Nodal and BMP2/4 pattern the mesoderm and endoderm during development of the sea urchin embryo. Development. 137, 223-235 (2010).
- Ernst, S. G. Offerings from an Urchin. Dev. Biol. 358, 285-294 (2011).
- McClay, D. R. Evolutionary crossroads in developmental biology: sea urchins. Development. 138, 2639-2648 (2011).
- Sodergren, E., et al. Research article – The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
- Roux, M. M., et al. A functional genomic and proteomic perspective of sea urchin calcium signaling and egg activation. Dev. Biol. 300, 416-433 (2006).
- Turner, P. R., Sheetz, M. P., Jaffe, L. A. Fertilization increases the polyphosphoinositide content of sea urchin eggs. Nature. 310, 414-415 (1984).
- Voronina, E., Marzluff, W. F., Wessel, G. M. Cyclin B synthesis is required for sea urchin oocyte maturation. Dev. Biol. 256, 258-275 (2003).
- Wong, J. L., Wessel, G. M. Extracellular matrix modifications at fertilization: regulation of dityrosine crosslinking by transamidation. Development. 136, 1835-1847 (2009).
- Shuster, C. B., Burgess, D. R. Transitions regulating the timing of cytokinesis in embryonic cells. Curr. Biol. 12, 854-858 (2002).
- Morris, R. L., et al. Analysis of cytoskeletal and motility proteins in the sea urchin genome assembly. Dev. Biol. 300, 219-237 (2006).
- Minc, N., Burgess, D., Chang, F. Influence of Cell Geometry on Division-Plane Positioning. Cell. 144, 414-426 (2011).
- Davidson, E. H., et al. A genomic regulatory network for development. Science. 295, 1669-1678 (2002).
- Oliveri, P., Tu, Q., Davidson, E. H. Global regulatory logic for specification of an embryonic cell lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5955-5962 (2008).
- Peter, I. S., Davidson, E. H. A gene regulatory network controlling the embryonic specification of endoderm. Nature. 474, (2011).
- Nam, J. M., Dong, P., Tarpine, R., Istrail, S., Davidson, E. H. Functional cis-regulatory genomics for systems biology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3930-3935 (2010).
- Showman, R. M., Foerder, C. A. Removal of the fertilization membrane of sea-urchin embryos employing aminotriazole. Exp. Cell Res. 120, 253-255 (1979).
- Lepage, T., Sardet, C., Gache, C. Spatial expression of the hatching enzyme gene in the sea-urchin embryo. Dev. Biol. 150, 23-32 (1992).
- Jaffe, L. A., Terasaki, M. Quantitative microinjection of oocytes, eggs, and embryos. Development of Sea Urchins, Ascidians, and Other Invertebrate Deuterostomes: Experimental Approaches. 74, 219-242 (2004).
