海胆受精卵的高通量显微注射
Summary
显微注射是用于递送DNA构建体，mRNA表达，吗啉代反义寡核苷酸或其它处理成卵，胚胎，以及不同物种的细胞中的常见技术。
Abstract
显微注射到细胞和胚胎是用来研究广泛的生物学过程的一种常用技术。在该方法中少量的处理溶液被装入一个用于物理地注入单个固定的细胞或胚胎显微注射针。尽管需要对初始训练才能执行此程序用于高通量输送，显微注射提供最高的效率和可重复性交付各种各样的治疗方案（包括样品的复杂混合物）进入细胞，卵子或胚胎。应用显微注射包括递送的DNA构建体，mRNA表达，重组蛋白，增益功能，以及功能的试剂的损失。荧光或比色染料被加入到注射溶液，以使有效地提供实时可视化，以及提供可靠的递送溶液的量的归一化的工具。所描述的方法，使产生100-400海胆Ž显微注射在10-15分钟ygotes。
Introduction
高效的和可重复的治疗分娩是为研究人员的主要方法上的挑战之一。几种方法已经被建立以瞬时传送处理溶液进入卵，胚胎，和细胞。这些方法包括电穿孔（基于使用短的电脉冲的产生瞬态毛孔中的膜）1,2，脂质转染（输送通过含有治疗的脂质体与细胞膜的融合体）1，微粒轰击1（沉淀DNA上的微米这随后被用来穿透细胞在高流速大小的金属颗粒），和转导（病毒被用作转基因的递送媒介物）。此刻，显微注射是保存提供任何溶液与100％的效率以最小的试剂的优点的唯一方法。此外，单一的注射液可组成一个处理复杂的鸡尾酒。这一技术已被用于成功LY微导的卵子和胚胎从众多种类，例如海胆3,4，斑马鱼5，鼠标器6，青蛙7，和牛8以及单个细胞在组织培养9。单个卵裂球在注射后的发育阶段也已经进行了10-12。
显微注射的当前方法是基于最初由平本10所述的压力注入法，但是，大的进展已经取得了这一过程的优化。优良的显微注射技术已在别处11描述了，这里我们介绍的是目前用于微导海胆（ 紫色球海胆 ）新受精卵的具体方法之一。一个多世纪以来，海胆是一个有价值的实验模型15,16。海胆是进化密切相关的脊索动物（包括我们），并分析它们的基因组发现，它们包含所有主要的基因家族的人17。他们生产了大量的同步开发，可以很容易地操纵胚胎透明的。利用海胆作为模式生物，海胆社会对我们的受精过程的理解18-21，细胞生物学过程22-24和基因调控网络（GRNS）25-28贡献。
显微注射到海胆受精卵需要几个步骤。首先，鸡蛋需要注射之前（在下面描述），固定。显微注射的菜肴都涂有硫酸鱼精蛋白（PS），它创建了一个带正电荷的表面到带负电荷的蛋能坚持3。将卵孵育在酸性海水（pH值5.15）10分钟dejellied，随后在天然海水或人工海水（pH8.0）中洗涤两次。该dejellied鸡蛋小心划在一条直线上在1mM的3 -氨基三唑（3-AT），这是需要抑制是从卵的皮质颗粒分泌为受精29的结果ovoperoxidase的活性存在PS涂 覆盘的中间。这个步骤是重要的，以防止受精信封的硬化，并促进微注射针条目。作为替代，以1mM的3-AT，10毫对氨基苯甲酸（PABA），都可以使用。注射溶液装入用专门的微负载枪头微注射针以及安装在连接到显微操纵器和压力单元的保持器（ 图1）。每根针可以用于微导合子个体中在不同的日子多个实验。可10-15分钟进行显微注射，直至受精卵变硬。受精卵然后用海水和培养在15℃下当到达胚胎孵化囊胚期，它们会释放孵化酶，消化外汇储备的组成部分tilization信封30，让他们自然地从PS-涂层盘分离。如果需要的话，将胚胎可以轻轻地从用口吸移管或巴斯德吸管海水轻轻地吹入胚胎培养皿分离。所描述的方法使得能够在一个单一的盘100-400新近受精的卵有效和可靠的显微注射，用于下游分析提供了一种高通量的方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
显微注射法是一种强大的技术用于递送各种治疗方法，如DNA，mRNA表达，重组蛋白，功能丧失和增益的功能的试剂，染料和它们的组合成蛋，胚胎，和各种生物1-7细胞。然而，设计一个显微注射实验的时候几方面的考虑，应牢记。
这是极为重要的是要考虑的递送治疗和注射量的溶解性。如果显微注射液趋向于形成即使是轻微的沉淀，在质注射针将被堵塞。一般来说，?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢圣地亚哥苏亚雷斯的手稿和贝蒂Cowgill援助在摄影的批判性阅读。我们也感谢匿名审稿人的批评性意见。这项工作是由特拉华大学的研究基金的支持。
Materials
| Glass pasteur pipettes | VWR | 14673-043 | |
| Inverted microscope Axiovert 40C | Zeiss | 4109431007990000 | Injection microscope |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | Load injection solution |
| Nylon filter mesh 80 μm | Amazon.com | 03-80-37 | Filter eggs to get rid of debris |
| P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips | Fisher Scientific | 02707432 or 02707430 | Part of a mouth pipette |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13 374 12 | Part of a mouth pipette |
| Polyethylene tubing | Intramedic | PE-160 | Part of a mouth pipette |
| Protamine sulfate | MP Biomedicals, LLC | 194729 | Attach dejellied eggs to injection dishes |
| Sea urchins S. purpuratus | Pt. Loma Marine Invertebrate Lab | N/A | |
| Sea water | any pet store | Instant Ocean | |
| Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | Injection dishes |
| Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1 | Narishige | 9124 | Manipulate injection needle |
| Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND | Narishige | 9212 | Manipulate injection needle |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Vertical needle puller | Narishige | PC-10 | Pull injection needles |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys.Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Peng, H., Wu, Y. Y., Zhang, Y. Efficient Delivery of DNA and Morpholinos into Mouse Preimplantation Embryos by Electroporation. Plos One. 7, 13 (2012).
- Ettensohn, C. A., Wray, G. A., Wessel, G. M. . eds. Development of sea urchins, ascidians, and other invertebrate deuterostomes: experimental approaches. 74, (2004).
- Franks, R. R., Houghevans, B. R., Britten, R. J., Davidson, E. H. Direct introduction of cloned DNA into the sea urchin zygote nucleus, and fate of injected DNA. Development. 102, 287-299 (1988).
- Kinsey, W. H. Analysis of signaling pathways in zebrafish development by microinjection. Methods Mol. Biol. 518, 67-76 (2009).
- Kola, I., Sumarsono, S. H. Microinjection of in vitro transcribed RNA and antisense oligonucleotides in mouse oocytes and early embryos to study the gain- and loss-of-function of genes. Mol. Biotechnol. 6, 191-199 (1996).
- Mishina, T., Fuchimukai, K., Igarashi, K., Tashiro, K., Shiokawa, K. Modification of secondary head-forming activity of microinjected a dagger beta-catenin mRNA by co-injected spermine and spermidine in Xenopus early embryos. Amino Acids. 42, 791-801 (2012).
- O’Meara, C. M., et al. Gene silencing in bovine zygotes: siRNA transfection versus microinjection. Reprod. Fertil. Dev. 23, 534-543 (2011).
- Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. Nonviral gene delivery. Cold Spring Harb. Protoc. , (2011).
- Hiramoto, Y. Cell division without mitotic apparatus in sea urchin eggs. Exp. Cell Res. 11, 630-636 (1956).
- Wilson, L. . Methods in Cell Biology. 25, (1982).
- Gross, J. M., McClay, D. R. The role of Brachyury (T) during gastrulation movements in the sea urchin Lytechinus variegatus. Dev. Biol. 239, 132-147 (2001).
- Yajima M, W. G. Autonomy in specification of primordial germ cells and their passive translocation in the sea urchin. Development. 139, 3786-3794 (2012).
- Duboc, V., et al. Nodal and BMP2/4 pattern the mesoderm and endoderm during development of the sea urchin embryo. Development. 137, 223-235 (2010).
- Ernst, S. G. Offerings from an Urchin. Dev. Biol. 358, 285-294 (2011).
- McClay, D. R. Evolutionary crossroads in developmental biology: sea urchins. Development. 138, 2639-2648 (2011).
- Sodergren, E., et al. Research article – The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
- Roux, M. M., et al. A functional genomic and proteomic perspective of sea urchin calcium signaling and egg activation. Dev. Biol. 300, 416-433 (2006).
- Turner, P. R., Sheetz, M. P., Jaffe, L. A. Fertilization increases the polyphosphoinositide content of sea urchin eggs. Nature. 310, 414-415 (1984).
- Voronina, E., Marzluff, W. F., Wessel, G. M. Cyclin B synthesis is required for sea urchin oocyte maturation. Dev. Biol. 256, 258-275 (2003).
- Wong, J. L., Wessel, G. M. Extracellular matrix modifications at fertilization: regulation of dityrosine crosslinking by transamidation. Development. 136, 1835-1847 (2009).
- Shuster, C. B., Burgess, D. R. Transitions regulating the timing of cytokinesis in embryonic cells. Curr. Biol. 12, 854-858 (2002).
- Morris, R. L., et al. Analysis of cytoskeletal and motility proteins in the sea urchin genome assembly. Dev. Biol. 300, 219-237 (2006).
- Minc, N., Burgess, D., Chang, F. Influence of Cell Geometry on Division-Plane Positioning. Cell. 144, 414-426 (2011).
- Davidson, E. H., et al. A genomic regulatory network for development. Science. 295, 1669-1678 (2002).
- Oliveri, P., Tu, Q., Davidson, E. H. Global regulatory logic for specification of an embryonic cell lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5955-5962 (2008).
- Peter, I. S., Davidson, E. H. A gene regulatory network controlling the embryonic specification of endoderm. Nature. 474, (2011).
- Nam, J. M., Dong, P., Tarpine, R., Istrail, S., Davidson, E. H. Functional cis-regulatory genomics for systems biology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3930-3935 (2010).
- Showman, R. M., Foerder, C. A. Removal of the fertilization membrane of sea-urchin embryos employing aminotriazole. Exp. Cell Res. 120, 253-255 (1979).
- Lepage, T., Sardet, C., Gache, C. Spatial expression of the hatching enzyme gene in the sea-urchin embryo. Dev. Biol. 150, 23-32 (1992).
- Jaffe, L. A., Terasaki, M. Quantitative microinjection of oocytes, eggs, and embryos. Development of Sea Urchins, Ascidians, and Other Invertebrate Deuterostomes: Experimental Approaches. 74, 219-242 (2004).
