High Throughput micro-injecties van Sea Urchin Zygotes
Summary
Microinjectie is een veelgebruikte techniek gebruikt om DNA constructen mRNA, morfolino antisense oligonucleotiden of andere behandelingen te leveren in eieren, embryo's en cellen van verschillende soorten.
Abstract
Micro-injectie in cellen en embryo is een veelgebruikte techniek die wordt gebruikt om een groot aantal biologische processen te bestuderen. Bij deze werkwijze wordt een kleine hoeveelheid behandelingsoplossing in een micro-injectie naald die wordt gebruikt fysiek afzonderlijke injecteren geïmmobiliseerde cellen of embryo geladen. Ondanks de behoefte aan initiatieopleiding deze procedure voor high-throughput levering, microinjectie biedt maximale efficiëntie en reproduceerbare levering van een breed scala van behandelende oplossingen (waaronder complexe mengsels van monsters) in cellen, eicellen of embryo's. Toepassingen op micro-injecties bevatten aflevering van DNA-constructen, mRNA, recombinante eiwitten, gain of function, en functieverlies reagentia. Fluorescente of colorimetrische kleurstof wordt toegevoegd aan de geïnjecteerde oplossing directe visualisatie van efficiënte levering en een instrument voor betrouwbare normalisatie van de hoeveelheid van de geleverde oplossing mogelijk. De beschreven methode maakt micro-injectie van 100-400 zee-egel zygotes binnen 10-15 minuten.
Introduction
Efficiënte en reproduceerbare behandeling levering is een van de belangrijkste methodologische uitdagingen voor onderzoekers. Verscheidene methoden zijn vastgesteld om behandelingsoplossingen tijdelijk te leveren in de eieren, embryo's en cellen. Deze methoden omvatten elektroporatie (gebaseerd op het genereren van tijdelijke poriën in het membraan met behulp van korte elektrische pulsen) 1,2, lipofectie (leverbaar door de fusie van behandeling met liposomen met het membraan) 1, bombardement met microdeeltjes 1 (DNA wordt geprecipiteerd op het micron -sized metalen deeltjes die vervolgens worden gebruikt om de cellen bij hoge snelheid doordringen) en transductie (virus wordt gebruikt als transportmiddel van transgenen). Momenteel, micro-injectie is de enige benadering die het voordeel biedt dat iedere oplossing met 100% rendement met minimale reagentia bezit. Bovendien kan een enkele injectie oplossing bestaat uit een complexe cocktail van behandelingen. Deze techniek is gebruikt om succesvollely microinject de eieren en embryo's uit tal van soorten, zoals zee-egels 3,4, zebravis 5, 6 muis, kikker 7, en runderen 8, alsmede enkele cellen in het weefsel cultuur 9. Single blastomeren injecties in latere ontwikkelingsstadia zijn ook uitgevoerd 10-12.
De huidige werkwijzen voor micro-injecties zijn gebaseerd op de druk-injectiemethode de aanvankelijk beschreven door Hiramoto 10, maar heeft grote vooruitgang geboekt optimalisatie van dit proces. Uitstekende micro-injectie technieken zijn elders 11 beschreven, en hier beschrijven we een van de specifieke methoden die momenteel gebruikt wordt om zee-egel (Strongylocentrotus purpuratus) nieuw bevruchte eieren microinject. Al meer dan een eeuw, hebben zee-egels een waardevol experimenteel model 15,16 geweest. Zee-egels zijn evolutionair nauw verwant aan chordates (waaronder wij) en analyse vanhun genoom onthulde dat ze alle belangrijke gen families als de menselijke 17 bevatten. Ze produceren een groot aantal synchroon ontwikkelen transparante embryo dat gemakkelijk kan worden gemanipuleerd. Het gebruik van zee-egel als modelorganisme, heeft de zee-egel gemeenschap bijgedragen aan ons begrip van de bevruchting proces 18-21, celbiologische processen 22-24, en het gen regulerende netwerken (GRNs) 25-28.
Micro-injectie in zee-egel zygotes vereist een aantal stappen. Ten eerste moeten de eieren worden geïmmobiliseerd voor injecties (hieronder beschreven). Micro-injectie gerechten worden bekleed met protamine sulfaat (PS), dat een positief geladen oppervlak waarop de negatief geladen eieren kan hechten 3 ontstaat. De eieren worden dejellied door incubatie in zure zeewater (pH 5.15) gedurende 10 minuten, gevolgd door twee wassingen in natuurlijk zeewater of kunstmatig zeewater (pH 8,0). De dejellied eieren worden zorgvuldig geroeid in een rechte lijnin het midden van PS-gecoate schaal in aanwezigheid van 1 mM 3-aminotriazool (3-AT), die nodig is om de activiteit van ovoperoxidase dat wordt afgescheiden uit de corticale korrels van het ei als gevolg van bevruchting remmen 29. Deze stap is belangrijk om verharding van de bevruchting envelop voorkomen en micro-injectie naald toetreding bewerkstelligen. Als alternatief voor 1 mM 3-AT, kan 10 mM paraminobenzoic zuur (PABA) worden gebruikt. De injectie-oplossing wordt in een micro-injectie naald met behulp van gespecialiseerde microloading pipettip geladen en gemonteerd op een houder bevestigd aan micromanipulator en druk unit (figuur 1). Elke naald kan worden gebruikt om individuele zygoten microinject in meerdere experimenten op verschillende dagen. Micro-injectie kan worden uitgevoerd gedurende 10-15 min tot de zygoten harden. De zygoten worden vervolgens met het zeewater en gekweekte gewassen bij 15 ° C. Wanneer het embryo bereiken uitkomen blastula stadium, geven ze uitbroeden enzym dat onderdelen van de fer verteerttilization envelop 30 en hen in staat stellen om op natuurlijke wijze los te maken van de PS-gecoate schaal. Indien nodig kan de embryo voorzichtig worden losgemaakt van de schaal met een mond pipet of Pasteur pipet zachtjes blazen zeewater op het embryo. De beschreven werkwijze maakt een efficiënte en betrouwbare micro-injectie van 100-400 bevruchte eieren op een schotel, die een high-throughput werkwijze voor downstream analyses.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microinjectie is een krachtige techniek voor het leveren van verschillende behandelingen zoals DNA, mRNA, recombinante eiwitten, functieverlies en overexpressie-reagentia, kleurstoffen en combinaties in eieren, embryo's en cellen van verschillende organismen 1-7. Er moet echter een aantal overwegingen in gedachten worden gehouden bij het ontwerpen van een micro-injectie experiment.
Het is uiterst belangrijk om de oplosbaarheid van de geleverde behandeling en het injectievolume…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Santiago Suarez voor kritische lezing van het manuscript en Betty Cowgill voor de steun in de fotografie. We danken ook de anonieme reviewers voor hun kritische feedback. Dit werk wordt ondersteund door het Fonds voor onderzoek Universiteit van Delaware.
Materials
| Glass pasteur pipettes | VWR | 14673-043 | |
| Inverted microscope Axiovert 40C | Zeiss | 4109431007990000 | Injection microscope |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | Load injection solution |
| Nylon filter mesh 80 μm | Amazon.com | 03-80-37 | Filter eggs to get rid of debris |
| P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips | Fisher Scientific | 02707432 or 02707430 | Part of a mouth pipette |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13 374 12 | Part of a mouth pipette |
| Polyethylene tubing | Intramedic | PE-160 | Part of a mouth pipette |
| Protamine sulfate | MP Biomedicals, LLC | 194729 | Attach dejellied eggs to injection dishes |
| Sea urchins S. purpuratus | Pt. Loma Marine Invertebrate Lab | N/A | |
| Sea water | any pet store | Instant Ocean | |
| Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | Injection dishes |
| Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1 | Narishige | 9124 | Manipulate injection needle |
| Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND | Narishige | 9212 | Manipulate injection needle |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Vertical needle puller | Narishige | PC-10 | Pull injection needles |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys.Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Peng, H., Wu, Y. Y., Zhang, Y. Efficient Delivery of DNA and Morpholinos into Mouse Preimplantation Embryos by Electroporation. Plos One. 7, 13 (2012).
- Ettensohn, C. A., Wray, G. A., Wessel, G. M. . eds. Development of sea urchins, ascidians, and other invertebrate deuterostomes: experimental approaches. 74, (2004).
- Franks, R. R., Houghevans, B. R., Britten, R. J., Davidson, E. H. Direct introduction of cloned DNA into the sea urchin zygote nucleus, and fate of injected DNA. Development. 102, 287-299 (1988).
- Kinsey, W. H. Analysis of signaling pathways in zebrafish development by microinjection. Methods Mol. Biol. 518, 67-76 (2009).
- Kola, I., Sumarsono, S. H. Microinjection of in vitro transcribed RNA and antisense oligonucleotides in mouse oocytes and early embryos to study the gain- and loss-of-function of genes. Mol. Biotechnol. 6, 191-199 (1996).
- Mishina, T., Fuchimukai, K., Igarashi, K., Tashiro, K., Shiokawa, K. Modification of secondary head-forming activity of microinjected a dagger beta-catenin mRNA by co-injected spermine and spermidine in Xenopus early embryos. Amino Acids. 42, 791-801 (2012).
- O’Meara, C. M., et al. Gene silencing in bovine zygotes: siRNA transfection versus microinjection. Reprod. Fertil. Dev. 23, 534-543 (2011).
- Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. Nonviral gene delivery. Cold Spring Harb. Protoc. , (2011).
- Hiramoto, Y. Cell division without mitotic apparatus in sea urchin eggs. Exp. Cell Res. 11, 630-636 (1956).
- Wilson, L. . Methods in Cell Biology. 25, (1982).
- Gross, J. M., McClay, D. R. The role of Brachyury (T) during gastrulation movements in the sea urchin Lytechinus variegatus. Dev. Biol. 239, 132-147 (2001).
- Yajima M, W. G. Autonomy in specification of primordial germ cells and their passive translocation in the sea urchin. Development. 139, 3786-3794 (2012).
- Duboc, V., et al. Nodal and BMP2/4 pattern the mesoderm and endoderm during development of the sea urchin embryo. Development. 137, 223-235 (2010).
- Ernst, S. G. Offerings from an Urchin. Dev. Biol. 358, 285-294 (2011).
- McClay, D. R. Evolutionary crossroads in developmental biology: sea urchins. Development. 138, 2639-2648 (2011).
- Sodergren, E., et al. Research article – The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
- Roux, M. M., et al. A functional genomic and proteomic perspective of sea urchin calcium signaling and egg activation. Dev. Biol. 300, 416-433 (2006).
- Turner, P. R., Sheetz, M. P., Jaffe, L. A. Fertilization increases the polyphosphoinositide content of sea urchin eggs. Nature. 310, 414-415 (1984).
- Voronina, E., Marzluff, W. F., Wessel, G. M. Cyclin B synthesis is required for sea urchin oocyte maturation. Dev. Biol. 256, 258-275 (2003).
- Wong, J. L., Wessel, G. M. Extracellular matrix modifications at fertilization: regulation of dityrosine crosslinking by transamidation. Development. 136, 1835-1847 (2009).
- Shuster, C. B., Burgess, D. R. Transitions regulating the timing of cytokinesis in embryonic cells. Curr. Biol. 12, 854-858 (2002).
- Morris, R. L., et al. Analysis of cytoskeletal and motility proteins in the sea urchin genome assembly. Dev. Biol. 300, 219-237 (2006).
- Minc, N., Burgess, D., Chang, F. Influence of Cell Geometry on Division-Plane Positioning. Cell. 144, 414-426 (2011).
- Davidson, E. H., et al. A genomic regulatory network for development. Science. 295, 1669-1678 (2002).
- Oliveri, P., Tu, Q., Davidson, E. H. Global regulatory logic for specification of an embryonic cell lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5955-5962 (2008).
- Peter, I. S., Davidson, E. H. A gene regulatory network controlling the embryonic specification of endoderm. Nature. 474, (2011).
- Nam, J. M., Dong, P., Tarpine, R., Istrail, S., Davidson, E. H. Functional cis-regulatory genomics for systems biology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3930-3935 (2010).
- Showman, R. M., Foerder, C. A. Removal of the fertilization membrane of sea-urchin embryos employing aminotriazole. Exp. Cell Res. 120, 253-255 (1979).
- Lepage, T., Sardet, C., Gache, C. Spatial expression of the hatching enzyme gene in the sea-urchin embryo. Dev. Biol. 150, 23-32 (1992).
- Jaffe, L. A., Terasaki, M. Quantitative microinjection of oocytes, eggs, and embryos. Development of Sea Urchins, Ascidians, and Other Invertebrate Deuterostomes: Experimental Approaches. 74, 219-242 (2004).
