À haut débit microinjections oursins zygotes
Summary
La micro-injection est une technique couramment utilisée pour fournir des constructions d'ADN, ARNm, des oligonucléotides morpholino antisens ou d'autres traitements dans les œufs, les embryons et les cellules de diverses espèces.
Abstract
La micro-injection dans des cellules et des embryons est une technique couramment utilisée pour étudier un grand nombre de processus biologiques. Dans ce procédé, une petite quantité de solution de traitement est chargée dans une aiguille de micro-injection qui est utilisée pour injecter physiquement les cellules immobilisées ou des embryons individuels. Malgré la nécessité d'une formation initiale pour effectuer cette procédure pour la livraison à haut débit, la micro-injection offre un maximum d'efficacité et de livraison reproductible d'une grande variété de solutions de traitement (y compris les mélanges complexes d'échantillons) dans les cellules, les ovules ou d'embryons. Applications aux micro-injections comprennent la livraison de constructions d'ADN, ARNm, protéines recombinantes, gain de fonction, et la perte de réactifs de fonction. Colorant fluorescent ou colorimétrique est ajouté à la solution injectée pour permettre la visualisation instantanée de la livraison efficace, ainsi que d'un outil pour la normalisation fiable de la quantité de la solution fournie. La méthode décrite permet la micro-injection de 100-400 oursin zygotes dans 10-15 min.
Introduction
L'administration du traitement efficace et reproductible est l'un des principaux défis méthodologiques pour les chercheurs. Plusieurs méthodes ont été mis en place pour fournir des solutions de traitement transitoire dans les oeufs, embryons et les cellules. Ces procédés comprennent l'électroporation (basé sur une génération de pores transitoires de la membrane à l'aide de courtes impulsions électriques) 1,2, la lipofection (livraison par la fusion de liposomes contenant au traitement avec la membrane) 1, 1 bombardement de microparticules (ADN est précipité sur le micron particules de taille métalliques qui sont ensuite utilisés pour pénétrer dans les cellules à grande vitesse), et la transduction (virus est utilisé en tant que véhicule de délivrance de transgènes). Pour le moment, la micro-injection est la seule approche qui détient l'avantage de délivrer une solution avec 100% d'efficacité avec des réactifs minimes. En outre, une solution d'injection unique peut être composée d'un mélange complexe de traitements. Cette technique a été utilisée avec succès pourment micro-injection des ovules et des embryons de nombreuses espèces tels que les oursins 3,4, poisson zèbre 5, 6 souris, grenouille 7, 8 et bovins ainsi que des cellules individuelles dans la culture de tissus 9. Blastomères simples injections à des stades de développement ultérieurs ont également été menées 10-12.
Les méthodes actuelles de micro-injections sont basés sur la méthode injection sous pression qui a été initialement décrit par Hiramoto 10, mais de grands progrès ont été accomplis en vue de l'optimisation de ce processus. D'excellentes techniques de micro-injection ont été décrites ailleurs 11, et ici nous décrire l'une des méthodes spécifiques qui sont actuellement utilisés pour micro-injection oursin (Strongylocentrotus purpuratus) des oeufs fécondés récemment. Depuis plus d'un siècle, les oursins ont été un précieux modèle expérimental 15,16. Les oursins sont étroitement liées à l'évolution, les chordés (nous y compris) et l'analyse deleur génome a révélé qu'ils contiennent toutes les grandes familles de gènes que l'homme 17. Ils produisent un grand nombre de pays en synchrone embryons transparents qui peuvent être facilement manipulées. Utilisation de l'oursin comme un organisme modèle, la communauté de l'oursin a contribué à notre compréhension du processus de la fécondation 18-21, les processus biologiques cellulaires 22-24, et les réseaux de régulation génétique (GRNS) 25-28.
Microinjection dans des zygotes d'oursins nécessite plusieurs étapes. Tout d'abord, les œufs doivent être immobilisées avant les injections (décrit ci-dessous). plats de microinjection sont revêtues avec de la protamine sulfate (PS), qui crée une surface chargée positivement à laquelle les oeufs chargés négativement peuvent adhérer 3. Les oeufs sont dejellied par incubation dans l'eau de mer acide (pH 5,15) pendant 10 min, suivie par deux lavages dans l'eau de mer naturelle ou de l'eau de mer artificielle (pH 8,0). Les œufs sont soigneusement dejellied ramé en ligne droiteau milieu du plat revêtu PS en présence de 1 mM de 3-aminotriazole (3-AT), qui est nécessaire pour inhiber l'activité de ovoperoxidase qui est sécrétée à partir des granules corticaux de l'œuf à la suite de la fécondation 29. Cette étape est importante pour empêcher le durcissement de l'enveloppe de la fécondation et de faciliter la pénétration de l'aiguille de micro-injection. Comme alternative à 1 mM 3-AT, 10 mM d'acide paraminobenzoic (PABA) peut être utilisé. La solution d'injection est chargé dans une aiguille de micro-injection en utilisant spécialisé microloading pointe de pipette et monté sur un support fixé au micromanipulateur et de l'unité de pression (figure 1). Chaque aiguille peut être utilisé pour micro-injection zygotes individuels dans de multiples expériences à des jours différents. La micro-injection peut être effectuée pendant 10-15 min jusqu'à ce que les zygotes durcissent. Les zygotes sont ensuite lavées avec de l'eau de mer et on cultive à 15 ° C. Lorsque les embryons atteignent l'éclosion blastula stade, ils libèrent une enzyme qui digère l'éclosion composantes du fertilization enveloppe 30 et leur permettent de se détacher naturellement de la PS plat revêtu. Si nécessaire, les embryons peuvent être doucement détachées de la boîte à l'aide d'une pipette de bouche ou une pipette Pasteur en soufflant doucement de l'eau de mer sur les embryons. La méthode décrite permet la micro-injection efficace et fiable de 100-400 oeufs fécondés récemment sur un plat unique, fournissant une méthode à haut débit pour les analyses en aval.
Protocol
Representative Results
Discussion
La micro-injection est une technique puissante pour délivrer divers traitements tels que l'ADN, l'ARNm, des protéines recombinantes, une perte de fonction et de gain de fonction de réactifs, les colorants et leurs combinaisons dans des œufs, des embryons et des cellules de divers organismes 7.1. Toutefois, plusieurs considérations doivent être gardées à l'esprit lors de la conception d'une expérience de micro-injection.
Il est extrêmement important de pre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Santiago Suarez pour la lecture critique du manuscrit et Betty Cowgill à l'aide de la photographie. Nous remercions également les relecteurs anonymes pour leurs commentaires critiques. Ce travail est soutenu par l'Université du Delaware Fonds de recherche.
Materials
| Glass pasteur pipettes | VWR | 14673-043 | |
| Inverted microscope Axiovert 40C | Zeiss | 4109431007990000 | Injection microscope |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | Load injection solution |
| Nylon filter mesh 80 μm | Amazon.com | 03-80-37 | Filter eggs to get rid of debris |
| P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips | Fisher Scientific | 02707432 or 02707430 | Part of a mouth pipette |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13 374 12 | Part of a mouth pipette |
| Polyethylene tubing | Intramedic | PE-160 | Part of a mouth pipette |
| Protamine sulfate | MP Biomedicals, LLC | 194729 | Attach dejellied eggs to injection dishes |
| Sea urchins S. purpuratus | Pt. Loma Marine Invertebrate Lab | N/A | |
| Sea water | any pet store | Instant Ocean | |
| Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | Injection dishes |
| Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1 | Narishige | 9124 | Manipulate injection needle |
| Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND | Narishige | 9212 | Manipulate injection needle |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Vertical needle puller | Narishige | PC-10 | Pull injection needles |
References
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