समुद्री साही युग्मनजों के उच्च throughput microinjections
Summary
Microinjection अंडे, भ्रूण, और विभिन्न प्रजातियों की कोशिकाओं में डीएनए निर्माणों, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides या अन्य उपचार देने के लिए इस्तेमाल एक आम तकनीक है.
Abstract
कोशिकाओं और भ्रूण में microinjection जैविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक आम तकनीक है. इस विधि में उपचार समाधान की एक छोटी राशि शारीरिक रूप से व्यक्ति immobilized कोशिकाओं या भ्रूण इंजेक्षन करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक microinjection सुई में भरी हुई है. उच्च throughput वितरण के लिए इस प्रक्रिया का प्रदर्शन करने के लिए प्रारंभिक प्रशिक्षण के लिए आवश्यकता के बावजूद, microinjection अधिकतम क्षमता और कोशिकाओं, अंडे या भ्रूण में (नमूने के जटिल मिश्रण सहित) के इलाज के समाधान की एक विस्तृत विविधता की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य वितरण प्रदान करता है. Microinjections के लिए आवेदन डीएनए निर्माणों, mRNAs, पुनः संयोजक प्रोटीन, समारोह के लाभ, और समारोह अभिकर्मकों के नुकसान का वितरण शामिल है. फ्लोरोसेंट या वर्णमिति डाई तत्काल कुशल प्रसव के दृश्य के रूप में अच्छी तरह के रूप में दिया समाधान की राशि की विश्वसनीय सामान्य बनाने के लिए एक उपकरण को सक्षम करने के लिए इंजेक्शन समाधान के लिए जोड़ा है. वर्णित विधि 100-400 समुद्री साही Z के microinjection सक्षम बनाता है10-15 मिनट के भीतर ygotes.
Introduction
कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य उपचार वितरण शोधकर्ताओं के लिए मुख्य methodological चुनौतियों में से एक है. कई तरीकों क्षणिक अंडे, भ्रूण, और कोशिकाओं में उपचार के समाधान देने के लिए स्थापित किया गया है. इन तरीकों में 1,2, lipofection (झिल्ली के साथ उपचार युक्त liposomes के विलय के माध्यम से वितरण) 1, microparticle बमबारी 1 (डीएनए माइक्रोन पर उपजी है (कम बिजली दालों का उपयोग झिल्ली में एक पैदा क्षणिक pores के आधार पर) electroporation शामिल आकार के धातु तब उच्च वेग में कोशिकाओं घुसना करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं कि कण), और पारगमन (वायरस transgenes की एक डिलीवरी वाहन के रूप में प्रयोग किया जाता है). फिलहाल, microinjection न्यूनतम अभिकर्मकों के साथ 100% दक्षता के साथ किसी भी समाधान पहुंचाने का लाभ रखती है कि केवल दृष्टिकोण है. इसके अलावा, एक इंजेक्शन समाधान उपचार की एक जटिल कॉकटेल से बना जा सकता है. इस तकनीक को सफल करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैly ऐसे समुद्री अर्चिन 3,4, ज़ेबरा मछली 5, माउस 6, मेंढक 7, और मवेशियों 8 के साथ ही टिशू कल्चर 9 में एकल कक्षों के रूप में कई प्रजातियों से अंडे और भ्रूण microinject. बाद में विकास के चरणों में एकल blastomeres इंजेक्शन भी 10-12 आयोजित किया गया है.
microinjections के मौजूदा तरीकों शुरू में Hiramoto 10 द्वारा बताया गया था कि दबाव इंजेक्शन पद्धति पर आधारित हैं, लेकिन, महान प्रगति इस प्रक्रिया का अनुकूलन की दिशा में किया गया है. बहुत बढ़िया microinjection तकनीक कहीं 11 में वर्णित किया गया है, और यहाँ हम वर्तमान में समुद्री साही (Strongylocentrotus purpuratus) नव निषेचित अंडे microinject के लिए प्रयोग किया जाता है कि विशिष्ट विधियों में से एक का वर्णन. एक सदी से भी अधिक के लिए, समुद्री अर्चिन एक मूल्यवान प्रयोगात्मक मॉडल 15,16 किया गया है. सागर अर्चिन evolutionarily बारीकी (हमारे सहित) Chordates और का विश्लेषण करने के लिए संबंधित हैंउनके जीनोम वे मानव के रूप में 17 के सभी प्रमुख जीन परिवारों होते हैं कि पता चला. वे synchronously आसानी से छेड़छाड़ की जा सकती है कि पारदर्शी भ्रूण के विकास की एक बड़ी संख्या का उत्पादन. एक मॉडल के रूप में जीव समुद्री साही का प्रयोग, समुद्री साही समुदाय हमारे निषेचन प्रक्रिया की समझ 18-21, सेल जैविक प्रक्रियाओं 22-24, और जीन विनियामक नेटवर्क (GRNs) 25-28 में योगदान दिया है.
समुद्री साही युग्मनजों में microinjection कई चरणों की आवश्यकता है. सबसे पहले, अंडे प्रायर (नीचे वर्णित) इंजेक्शन के लिए स्थिर हो की जरूरत है. Microinjection व्यंजन जो नकारात्मक आरोप लगाया अंडे 3 पालन कर सकते हैं करने के लिए एक सकारात्मक आरोप लगाया सतह बनाता है जो protamine सल्फेट (पीएस), के साथ लेपित हैं. अंडे प्राकृतिक समुद्र के पानी या कृत्रिम समुद्र के पानी (8.0 पीएच) में दो washes के द्वारा पीछा किया, 10 मिनट के लिए अम्लीय पानी समुद्र में ऊष्मायन (पीएच 5.15) द्वारा dejellied रहे हैं. dejellied अंडे ध्यान से एक सीधी रेखा में rowed रहे हैंनिषेचन 29 का एक परिणाम के रूप में अंडे के cortical कणिकाओं से स्रावित होता है कि ovoperoxidase की गतिविधि को बाधित करने के लिए आवश्यक है जो 1 मिमी 3 aminotriazole (3) में, की उपस्थिति में पुनश्च लेपित पकवान के बीच में. यह कदम निषेचन लिफाफा का सख्त को रोकने के लिए और microinjection सुई प्रवेश की सुविधा के लिए महत्वपूर्ण है. 1 मिमी 3 में करने के लिए एक विकल्प के रूप में 10 मिमी paraminobenzoic एसिड (PABA) का उपयोग किया जा सकता है. इंजेक्शन समाधान विशेष microloading पिपेट टिप का उपयोग कर एक microinjection सुई में भरी हुई है और micromanipulator और दबाव यूनिट से जुड़े एक धारक (चित्रा 1) पर मुहिम शुरू की है. प्रत्येक सुई अलग दिनों पर कई प्रयोगों में व्यक्तिगत युग्मनजों microinject करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. युग्मनजों कठोर जब तक microinjection 10-15 मिनट के लिए किया जा सकता है. युग्मनजों फिर 15 डिग्री सेल्सियस पर समुद्र के पानी के साथ और सुसंस्कृत धो रहे हैं भ्रूण ब्लासटुला चरण सेने तक पहुँचते हैं, वे fer के घटकों हज़म कि अंडे सेने एंजाइम रिलीजtilization लिफाफा 30 और उन्हें स्वाभाविक रूप से पी एस लेपित पकवान से अलग करने के लिए अनुमति देते हैं. यदि आवश्यक हो, भ्रूण धीरे धीरे भ्रूण पर समुद्र का पानी बह द्वारा एक मुँह पिपेट या पाश्चर पिपेट का उपयोग पकवान से अलग किया जा सकता है. वर्णित विधि बहाव के विश्लेषण के लिए एक उच्च throughput विधि उपलब्ध कराने, एक ही पकवान पर 100-400 नव निषेचित अंडे के कुशल और विश्वसनीय microinjection सक्षम बनाता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microinjection डीएनए, mRNA, पुनः संयोजक प्रोटीन, समारोह के नुकसान और अंडे, भ्रूण, और विभिन्न जीवों 1-7 की कोशिकाओं में समारोह अभिकर्मकों, रंग और उनके संयोजन के लाभ के रूप में विभिन्न उपचार देने के लिए एक शक्तिशाली …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम फोटोग्राफी में सहायता के लिए पांडुलिपि और बेटी Cowgill के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए सैंटियागो सुआरेज़ धन्यवाद. हम भी उनके महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया के लिए अनाम समीक्षक धन्यवाद. इस काम के विश्वविद्यालय डेलावेयर रिसर्च फंड द्वारा समर्थित है.
Materials
| Glass pasteur pipettes | VWR | 14673-043 | |
| Inverted microscope Axiovert 40C | Zeiss | 4109431007990000 | Injection microscope |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | Load injection solution |
| Nylon filter mesh 80 μm | Amazon.com | 03-80-37 | Filter eggs to get rid of debris |
| P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips | Fisher Scientific | 02707432 or 02707430 | Part of a mouth pipette |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13 374 12 | Part of a mouth pipette |
| Polyethylene tubing | Intramedic | PE-160 | Part of a mouth pipette |
| Protamine sulfate | MP Biomedicals, LLC | 194729 | Attach dejellied eggs to injection dishes |
| Sea urchins S. purpuratus | Pt. Loma Marine Invertebrate Lab | N/A | |
| Sea water | any pet store | Instant Ocean | |
| Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | Injection dishes |
| Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1 | Narishige | 9124 | Manipulate injection needle |
| Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND | Narishige | 9212 | Manipulate injection needle |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Vertical needle puller | Narishige | PC-10 | Pull injection needles |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys.Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Peng, H., Wu, Y. Y., Zhang, Y. Efficient Delivery of DNA and Morpholinos into Mouse Preimplantation Embryos by Electroporation. Plos One. 7, 13 (2012).
- Ettensohn, C. A., Wray, G. A., Wessel, G. M. . eds. Development of sea urchins, ascidians, and other invertebrate deuterostomes: experimental approaches. 74, (2004).
- Franks, R. R., Houghevans, B. R., Britten, R. J., Davidson, E. H. Direct introduction of cloned DNA into the sea urchin zygote nucleus, and fate of injected DNA. Development. 102, 287-299 (1988).
- Kinsey, W. H. Analysis of signaling pathways in zebrafish development by microinjection. Methods Mol. Biol. 518, 67-76 (2009).
- Kola, I., Sumarsono, S. H. Microinjection of in vitro transcribed RNA and antisense oligonucleotides in mouse oocytes and early embryos to study the gain- and loss-of-function of genes. Mol. Biotechnol. 6, 191-199 (1996).
- Mishina, T., Fuchimukai, K., Igarashi, K., Tashiro, K., Shiokawa, K. Modification of secondary head-forming activity of microinjected a dagger beta-catenin mRNA by co-injected spermine and spermidine in Xenopus early embryos. Amino Acids. 42, 791-801 (2012).
- O’Meara, C. M., et al. Gene silencing in bovine zygotes: siRNA transfection versus microinjection. Reprod. Fertil. Dev. 23, 534-543 (2011).
- Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. Nonviral gene delivery. Cold Spring Harb. Protoc. , (2011).
- Hiramoto, Y. Cell division without mitotic apparatus in sea urchin eggs. Exp. Cell Res. 11, 630-636 (1956).
- Wilson, L. . Methods in Cell Biology. 25, (1982).
- Gross, J. M., McClay, D. R. The role of Brachyury (T) during gastrulation movements in the sea urchin Lytechinus variegatus. Dev. Biol. 239, 132-147 (2001).
- Yajima M, W. G. Autonomy in specification of primordial germ cells and their passive translocation in the sea urchin. Development. 139, 3786-3794 (2012).
- Duboc, V., et al. Nodal and BMP2/4 pattern the mesoderm and endoderm during development of the sea urchin embryo. Development. 137, 223-235 (2010).
- Ernst, S. G. Offerings from an Urchin. Dev. Biol. 358, 285-294 (2011).
- McClay, D. R. Evolutionary crossroads in developmental biology: sea urchins. Development. 138, 2639-2648 (2011).
- Sodergren, E., et al. Research article – The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
- Roux, M. M., et al. A functional genomic and proteomic perspective of sea urchin calcium signaling and egg activation. Dev. Biol. 300, 416-433 (2006).
- Turner, P. R., Sheetz, M. P., Jaffe, L. A. Fertilization increases the polyphosphoinositide content of sea urchin eggs. Nature. 310, 414-415 (1984).
- Voronina, E., Marzluff, W. F., Wessel, G. M. Cyclin B synthesis is required for sea urchin oocyte maturation. Dev. Biol. 256, 258-275 (2003).
- Wong, J. L., Wessel, G. M. Extracellular matrix modifications at fertilization: regulation of dityrosine crosslinking by transamidation. Development. 136, 1835-1847 (2009).
- Shuster, C. B., Burgess, D. R. Transitions regulating the timing of cytokinesis in embryonic cells. Curr. Biol. 12, 854-858 (2002).
- Morris, R. L., et al. Analysis of cytoskeletal and motility proteins in the sea urchin genome assembly. Dev. Biol. 300, 219-237 (2006).
- Minc, N., Burgess, D., Chang, F. Influence of Cell Geometry on Division-Plane Positioning. Cell. 144, 414-426 (2011).
- Davidson, E. H., et al. A genomic regulatory network for development. Science. 295, 1669-1678 (2002).
- Oliveri, P., Tu, Q., Davidson, E. H. Global regulatory logic for specification of an embryonic cell lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5955-5962 (2008).
- Peter, I. S., Davidson, E. H. A gene regulatory network controlling the embryonic specification of endoderm. Nature. 474, (2011).
- Nam, J. M., Dong, P., Tarpine, R., Istrail, S., Davidson, E. H. Functional cis-regulatory genomics for systems biology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3930-3935 (2010).
- Showman, R. M., Foerder, C. A. Removal of the fertilization membrane of sea-urchin embryos employing aminotriazole. Exp. Cell Res. 120, 253-255 (1979).
- Lepage, T., Sardet, C., Gache, C. Spatial expression of the hatching enzyme gene in the sea-urchin embryo. Dev. Biol. 150, 23-32 (1992).
- Jaffe, L. A., Terasaki, M. Quantitative microinjection of oocytes, eggs, and embryos. Development of Sea Urchins, Ascidians, and Other Invertebrate Deuterostomes: Experimental Approaches. 74, 219-242 (2004).
