High Throughput microiniezioni di Sea Urchin zigoti
Summary
Microiniezione è una tecnica comune per fornire strutture di DNA, mRNA, oligonucleotidi antisenso morfolino o altri trattamenti in uova, embrioni e cellule di varie specie.
Abstract
Microiniezione in cellule ed embrioni è una tecnica comune utilizzata per studiare una vasta gamma di processi biologici. In questo metodo una piccola quantità di soluzione di trattamento viene caricato in un ago microiniezione che viene utilizzato per iniettare fisicamente cellule immobilizzate singole o embrioni. Nonostante la necessità di formazione iniziale per eseguire questa procedura per la consegna ad alta produttività, microiniezione offre la massima efficienza e la consegna riproducibile di una vasta gamma di soluzioni di trattamento (comprese le miscele complesse di campioni) nelle cellule, uova o embrioni. Applicazioni alle microiniezioni includono la consegna dei costrutti di DNA, mRNA, proteine ricombinanti, guadagno di funzione, e la perdita di reagenti funzione. Fluoroforo o colorimetrica viene aggiunto alla soluzione iniettata per consentire la visualizzazione immediata della consegna efficiente e un attrezzo per la normalizzazione affidabili della quantità della soluzione erogata. Il metodo descritto consente microiniezione di 100-400 ricci di mare zygotes entro 10-15 minuti.
Introduction
Consegna trattamento efficace e riproducibile è una delle principali sfide metodologiche per i ricercatori. Diversi metodi sono stati stabiliti per fornire transitoriamente soluzioni di trattamento nelle uova, embrioni e cellule. Questi metodi includono elettroporazione (basato su una generano transitori pori nella membrana mediante piccoli impulsi elettrici) 1,2, lipofezione (consegna attraverso la fusione di liposomi contenenti trattamento con la membrana) 1, microparticelle bombardamento 1 (DNA viene precipitato sulla micron particelle di dimensioni metallo che vengono poi utilizzati per penetrare le celle ad alta velocità) e trasduzione (virus viene utilizzato come veicolo di consegna di transgeni). Al momento, la microiniezione è l'unico approccio che tiene il vantaggio di fornire qualsiasi soluzione con un'efficienza del 100% con reagenti minimi. Inoltre, una singola soluzione iniettabile può essere composta da una miscela complessa di trattamenti. Questa tecnica è stata utilizzata per successoly microinject le uova e gli embrioni da numerose specie come ricci di mare, pesce zebra 3,4 5, mouse 6, rana 7, 8 e bovini, nonché singole cellule in coltura tissutale 9. Blastomeri singole iniezioni a stadi di sviluppo successivi sono stati condotti anche 10-12.
Gli attuali metodi di microiniezioni sono basati sul metodo della pressione di iniezione che è stato inizialmente descritto da Hiramoto 10, tuttavia, sono stati fatti grandi progressi verso l'ottimizzazione di questo processo. Eccellente tecniche di microiniezione sono state descritte altrove 11, e qui descrivere uno dei metodi specifici attualmente utilizzati per microinject riccio di mare (Strongylocentrotus purpuratus) le uova appena fecondate. Per oltre un secolo, ricci di mare sono stati un valido modello sperimentale 15,16. I ricci di mare sono evolutivamente strettamente legati alla cordati (compresi noi) e l'analisi diloro genoma ha rivelato che contengono tutte le principali famiglie di geni come l'umano 17. Essi producono un gran numero di sincrono sviluppare embrioni trasparenti che possono essere facilmente manipolati. Utilizzo di riccio di mare come organismo modello, la comunità riccio di mare ha contribuito alla nostra comprensione del processo di fecondazione 18-21, cellulari processi biologici 22-24, e le reti di regolazione genica (GRN) 25-28.
Microiniezione in zigoti riccio di mare richiede diversi passaggi. In primo luogo, le uova devono essere immobilizzato prima iniezioni (descritto di seguito). Piatti microiniezione sono rivestiti con protamina solfato (PS), che crea una superficie caricata positivamente a cui le uova carica negativa possono aderire 3. Le uova sono dejellied mediante incubazione in acqua di mare acida (pH 5,15) per 10 minuti, seguito da due lavaggi in acqua di mare naturale o acqua di mare artificiale (pH 8,0). Le uova dejellied sono accuratamente remato in linea rettanel mezzo del piatto PS rivestite in presenza di 1 mM 3-aminotriazole (3-AT), necessaria per inibire l'attività di ovoperoxidase che viene secreto dai granuli corticali dell'uovo a seguito di fecondazione 29. Questa fase è importante per prevenire l'indurimento della busta fecondazione e l'inserimento dell'ago microiniezione. In alternativa a 1 mM 3-AT, 10 mM acido paraminobenzoic (PABA) può essere utilizzato. La soluzione iniettabile viene caricato in un ago microiniezione punta utilizzando microloading pipetta specializzata e montato su un supporto attaccato al micromanipolatore e gruppo pressore (Figura 1). Ogni ago può essere utilizzato per microinject singoli zigoti in esperimenti multipli in giorni diversi. Microiniezione può essere eseguita per 10-15 minuti fino zigoti indurire. Gli zigoti vengono quindi lavati con acqua di mare e coltivate a 15 ° C. Quando gli embrioni raggiungono cova blastula fase, rilasciano cova enzima che digerisce i componenti del fertilization busta 30 e permettere loro di staccarsi naturalmente dal piatto di PS-rivestito. Se necessario, gli embrioni possono essere staccate delicatamente dal piatto con una pipetta bocca o pipetta Pasteur soffiando delicatamente l'acqua di mare sulle embrioni. Il metodo descritto consente microiniezione efficiente ed affidabile di 100-400 uova fecondate giudicato su un singolo piatto, fornendo un metodo ad alta produttività per analisi a valle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microiniezione è una tecnica potente per somministrare vari trattamenti quali DNA, mRNA, proteine ricombinanti, perdita di funzione e guadagno di funzione reagenti, coloranti e loro combinazioni in uova, embrioni e cellule di diversi organismi 1-7. Tuttavia, alcune considerazioni devono essere tenuti a mente quando si progetta un esperimento microiniezione.
E 'estremamente importante considerare la solubilità del trattamento consegnato e il volume di iniezione. Se la s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Santiago Suarez per la lettura critica del manoscritto e Betty Cowgill per gli aiuti in fotografia. Ringraziamo anche i revisori anonimi per il loro feedback critico. Questo lavoro è supportato dalla University of Delaware Fondo di ricerca.
Materials
| Glass pasteur pipettes | VWR | 14673-043 | |
| Inverted microscope Axiovert 40C | Zeiss | 4109431007990000 | Injection microscope |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | Load injection solution |
| Nylon filter mesh 80 μm | Amazon.com | 03-80-37 | Filter eggs to get rid of debris |
| P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips | Fisher Scientific | 02707432 or 02707430 | Part of a mouth pipette |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13 374 12 | Part of a mouth pipette |
| Polyethylene tubing | Intramedic | PE-160 | Part of a mouth pipette |
| Protamine sulfate | MP Biomedicals, LLC | 194729 | Attach dejellied eggs to injection dishes |
| Sea urchins S. purpuratus | Pt. Loma Marine Invertebrate Lab | N/A | |
| Sea water | any pet store | Instant Ocean | |
| Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | Injection dishes |
| Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1 | Narishige | 9124 | Manipulate injection needle |
| Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND | Narishige | 9212 | Manipulate injection needle |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Vertical needle puller | Narishige | PC-10 | Pull injection needles |
References
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