ウニ​​接合体のハイスループットマイクロインジェクション

Summary

マイクロインジェクションは、卵、胚、および種々の種の細胞にDNA構築物、mRNAは、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは他の治療法を送達するために使用される一般的な技術である。

Abstract

細胞および胚へのマイクロインジェクションは、広範囲の生物学的プロセスを研究するために使用される一般的な技術である。この方法では、処理溶液の少量は、物理的に個々の固定化細胞または胚を注入するために使用されているマイクロインジェクション針の中に装填される。ハイスループット配信のためにこの手順を実行するには、最初のトレーニングの必要性にもかかわらず、マイクロインジェクションは、細胞、卵や胚に最大の効率と（サンプルの複雑な混合物を含む）処理溶液の多種多様な再生可能な配信を提供しています。微量注入への応用DNAの送達は、mRNAが、組換えタンパク質、機能の獲得、および機能試薬の損失を構築挙げられる。蛍光または比色染料がインスタント効率的な配信の可視化だけでなく、送達される溶液の量を確実に正常化するためのツールを有効にするために注入された溶液に添加される。記載されている方法は、100〜400ウニzのマイクロインジェクションを可能にします10〜15分内ygotes。

Introduction

効率的で再現性のある治療照射は、研究者のための主要な方法論的課題の一つである。いくつかの方法が一過卵、胚、および細胞への治療ソリューションを提供するために設立されました。これらの方法には^、1,2、リポフェクション（膜を用いた治療を含むリポソームの融合による配送^）1、微粒子衝撃^1（DNAはミクロンに析出（短い電気パルスを用いて、膜内の生成過渡毛穴に基づく）エレクトロポレーションサイズの金属次いで高速で細胞に浸透するのに使用される粒子）、および形質導入（ウイルス導入遺伝子の送達ビヒクルとして使用される）。現時点では、マイクロインジェクション、最小限の試薬を用いた100％の効率で任意のソリューションを提供する利点を保持している唯一の方法である。また、単回注射液は処理の複雑な混合物から構成することができる。この技術は、成功するために使用されているLYなウニ^3,4、ゼブラフィッシュ^5、マウス^6、カエル^7、牛⁸だけでなく、組織培養⁹の単一細胞などの多数の種から卵や胚をマイクロインジェクション。後で発達段階での単一割球の注射はまた^{10月12日に}実施されている。

マイクロインジェクションの現在の方法は、最初に平本¹⁰によって記載された加圧注入法に基づいているが、大きな進歩は、このプロセスの最適化に向けて行われている。優れたマイクロインジェクション技術は、他の場所で^11を記載されており、ここで我々は現在、ウニ（Strongylocentrotus purpuratus）新たに受精卵をマイクロインジェクションするために使用され、特定のいずれかの方法を説明します。一世紀以上の場合は、ウニ、貴重な実験モデル^15,16となっている。ウニ​​は、進化的に密接に（私たちも含む）脊索動物との分析に関連しているそれらのゲノムは、彼らが人間の¹⁷のように、すべての主要な遺伝子ファミリーが含まれていることを明らかにした。それらは、同期を容易に操作することができる透明な胚を現像多数を生成する。モデル生物としてウニを使用して、ウニのコミュニティが受精過程^18〜21の我々の理解に貢献してきました、細胞生物学的プロセス^22〜24、および遺伝子調節ネットワーク^{（GRNs）25〜28。}

ウニ​​の受精卵へのマイクロインジェクションには、いくつかのステップが必要です。まず、卵は、従来の注射（後述）に固定化される必要がある。マイクロインジェクション皿を負に帯電した卵が^3を接着することができ、正に荷電した表面を作成し、硫酸プロタミン（PS）でコーティングされている。卵は、自然海水又は人工海水（pH8.0）中で2回洗浄した酸性海水に10分間液（pH 5.15）中でインキュベートしdejelliedされる。 dejellied卵を慎重に一直線に漕いている受精²⁹の結果、卵の皮質の顆粒から分泌されるovoperoxidaseの活性を阻害するのに必要とされる1 mMの3 -アミノトリアゾール（3-AT）の存在下でのPSでコーティングされた皿の中央にある。このステップは、受精エンベロープの硬化を防止し、マイクロインジェクション針進入を容易にすることが重要である。 1mMの3-ATの代替として、10mMのパラアミノ安息香酸（PABA）を用いることができる。注射液は、特殊なマイクロローディングピペットチップを用いてマイクロインジェクション針にロードされ、マイクロマニピュレータ及び圧力装置（ 図1）に取り付けられたホルダに取り付けられている。各針は、別々の日に複数の実験における個々の接合体のマイクロインジェクションするために使用することができる。接合体が硬化するまで、マイクロインジェクションは、10〜15分間行うことができる。接合体は、その後、15℃の海水培養で洗浄する胚は胞胚段階に孵化に到達すると、それらはFERのコンポーネントを消化孵化酵素をリリースtilizationエンベロープ³⁰と、それらが自然に、PSでコーティングされた皿から切り離すことができます。必要ならば、胚は、胚に穏やかに穏やかに海水を吹き付け口ピペットまたはパスツールピペットを用いてディッシュから剥離することができる。記載された方法は、下流の分析のためのハイスループット法を提供する、単一皿上100-400新たに受精した卵の効率的かつ信頼性の高いマイクロインジェクションを可能にする。

Protocol

1。硫酸プロタミンの製造（PS）コートディッシュ 50mlコニカルチューブ中の脱イオン蒸留水（のddH 2 O）50mlに0.5gのPSを添加して硫酸プロタミン（PS）の1％溶液を調製する。 PSの完全な溶解を確実にするために1〜2時間室温でベンチシェーカー上で高速によく振る。この溶液を3（完全に、使用前にゲル状の沈殿物を溶解することを確認する）少なくとも3ヶ月間、4℃で保?…

Representative Results

GFPとmCherryレポーター構築物は、in vitroで転写され、新たに受精卵に微量注入していた。胚（胞胚期まで）24時間15℃でインキュベートし、ツァイスオブザーバーZ1顕微鏡を用いて画像化した。レポーター構築物の注入は任意の発達障害（ 図6）には至らなかった。蛍光シグナルの定量化のため、画像取得を最大限蛍光画素（ 図6D〜F）を捕捉するために低?…

Discussion

マイクロインジェクションは、DNA、mRNAを、組換えタンパク質、卵、胚、および様々な生物^1-7の細胞への機能と関数試薬、染料およびそれらの組み合わせの利得の損失などの様々な治療を提供するための強力な手法です。マイクロインジェクション実験を設計する場合ただし、いくつかの考慮事項が心に留めておくべきである。

これは、送達処置および注入量の?…

Materials

Glass pasteur pipettes	VWR	14673-043
Inverted microscope Axiovert 40C	Zeiss	4109431007990000	Injection microscope
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003	Load injection solution
Nylon filter mesh 80 μm	Amazon.com	03-80-37	Filter eggs to get rid of debris
P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips	Fisher Scientific	02707432 or 02707430	Part of a mouth pipette
Parafilm	Fisher Scientific	13 374 12	Part of a mouth pipette
Polyethylene tubing	Intramedic	PE-160	Part of a mouth pipette
Protamine sulfate	MP Biomedicals, LLC	194729	Attach dejellied eggs to injection dishes
Sea urchins S. purpuratus	Pt. Loma Marine Invertebrate Lab	N/A
Sea water	any pet store	Instant Ocean
Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish	Fisher Scientific	0875713A	Injection dishes
Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1	Narishige	9124	Manipulate injection needle
Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND	Narishige	9212	Manipulate injection needle
Transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM
Vertical needle puller	Narishige	PC-10	Pull injection needles