성게 접합자의 높은 처리량 Microinjections
Summary
미세 주입 계란, 배아, 다양한 종류의 세포로 DNA의 구조, mRNA를, 모르 폴리 노의 안티센스 올리고 뉴클레오티드 또는 다른 치료를 제공하는 데 사용되는 일반적인 기술입니다.
Abstract
세포 및 배아로 마이크로 인젝션은 생물학적 과정의 광범위한 연구하는 데 사용되는 일반적인 기술이다. 이 방법에서는 처리 액의 소량의 개별 물리적 고정화 세포 또는 배아를 주입하는 데 사용되는 마이크로 인젝션 니들에로드된다. 높은 처리량 전달을 위해이 절차를 수행하려면 초기 교육의 필요성에도 불구하고, 미세 주입은 최대의 효율성과 세포, 계란 또는 태아에 (샘플의 복잡한 혼합물을 포함한다) 치료 솔루션의 다양한 재현 배달을 제공합니다. microinjections에 응용 프로그램은 DNA의 구조, mRNA를, 재조합 단백질, 기능의 증가, 기능 시약의 손실 전달 있습니다. 형광 또는 비색 염료 인스턴트 효율적인 전달 시각화뿐만 아니라 전달되는 용액의 양의 신뢰성 정상화하기위한 도구를 사용하는 주입 용액에 첨가된다. 한 방법은 100 ~ 400 성게 Z의 미세 주입을 가능하게10 ~ 15 분 이내 ygotes.
Introduction
효율적이고 재생 가능한 치료 배달 연구원의 주요 방법론적인 문제 중 하나입니다. 여러 가지 방법이 일시적으로 계란, 배아 세포로 치료 솔루션을 제공하기 위해 설립되었습니다. 이러한 방법은 1, 2, 리포 펙 (막 치료 함유 리포좀의 융합을 통해 배달) 1, 미세 충격 1 (DNA가 마이크론에 침전 (짧은 전기 펄스를 사용하여 막에서 생성 과도 모공 기준) 일렉트로 포함 크기의 금속 후 고속으로 세포에 침투하는 데 사용되는 입자) 및 전달 (바이러스가 도입 유전자의 전달 수단으로 사용된다.) 이때, 마이크로 인젝션 시약은 최소한 100 %의 효율로 임의의 솔루션을 제공하는 장점을 보유하는 유일한 방법이다. 또한, 단일 주입 용액 처리의 복잡한 칵테일로 구성 될 수있다. 이 방법은 성공적으로 사용되어왔다LY는 성게 3,4, 얼룩말 물고기 5, 마우스, 6, 7, 개구리, 소 8뿐만 아니라 조직 배양 9 단일 세포와 같은 많은 종에서 계란과 배아를 microinject. 나중에 발달 단계에서 단일 할구 주사는 10-12를 실시하고 있습니다.
microinjections의 현재의 방법은 처음 Hiramoto 10에 의해 설명 된 감압 주입법에 기반하지만, 실력이 프로세스의 최적화를 향해 제되었다. 우수한 미세 주입 기술은 다른 11에 설명되어 있고, 여기에 우리가 현재 성게 (Strongylocentrotus의 purpuratus) 새로 수정 된 알을 microinject하는 데 사용되는 특정 방법 중 하나를 설명합니다. 세기 이상, 성게 가치있는 실험 모델 (15, 16)하고있다. 성게는 진화 적으로 밀접하게 (우리 포함) 척색 동물과 분석에 관련된자신의 게놈은 인간의 17과 같은 모든 주요 유전자 가족을 포함하는 것으로 나타났습니다. 그들은 기적으로 쉽게 조작 할 수있는 투명 배아 개발의 다수 생산. 모델 생물로 성게를 사용하여, 성게 사회는 우리의 수정 과정의 이해 18-21, 세포 생물학적 과정 22 ~ 24, 및 유전자 조절 네트워크 (GRNs) 25 ~ 28에 기여하고있다.
성게의 수정란에 미세 주입 몇 가지 단계가 필요합니다. 첫째, 계란은 사전 (아래에 설명) 주사에 고정 될 필요가있다. 미세 주입 요리는 음으로 대전 된 계란 3을 준수 할 수있는 양으로 대전 된 표면을 생성 프로타민 황산 (PS)로 코팅되어있다. 계란은 천연 해수 또는 인공 해수 (산도 8.0)의 두 세척 한 다음, 10 분 동안 산성 바닷물에서 배양 (산도 5.15)에 의해 dejellied됩니다. dejellied 계란은 신중하게 직선으로 저어됩니다시비 (29)의 결과로 계란의 피질에서 과립 분비 ovoperoxidase의 활성을 억제하는 데 필요한 1 내지 3mm aminotriazole-(3-AT)의 존재하에 PS 코팅 접시의 중앙. 이 단계는 시비 포락선의 경화를 방지하고, 마이크로 인젝션 니들 진입을 용이하게하기 위해 중요하다. 1 mM의 3-AT에 대한 대안으로, 10 mM의 paraminobenzoic 산 (PABA)이 사용될 수있다. 주사액 전문 마이크로 로딩 피펫 팁을 사용하는 마이크로 인젝션 용 바늘에로드 micromanipulator에 압력 부에 부착 된 홀더 (도 1)에 장착된다. 각각의 바늘은 별도의 일에 대한 여러 실험에서 각각의 접합자를 microinject하는 데 사용할 수 있습니다. 접합자가 강화 될 때까지 미세 주입은 15 분 동안 수행 할 수 있습니다. 접합자는 다음 15 ℃에서 바다 물을 배양 세척 배아 blastula 단계 부화에 도달하면, 그들은 그다지의 구성 요소를 소화 부화 효소를 해제tilization 봉투 (30)과 그들을 자연스럽게 PS-코팅 접시에서 분리 할 수 있습니다. 필요한 경우, 배아 부드럽게 부드럽게 배아에 해수를 불어 입 피펫 또는 파스퇴르 피펫을 사용하여 접시로부터 분리 될 수있다. 설명 된 방법은 다운 스트림 분석을위한 높은 처리량을 제공하는 방법, 하나의 접시 100-400 새롭게 수정란의 효율적이고 신뢰성있는 미세 주입을 가능하게한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
미세 주입은 DNA, mRNA의, 재조합 단백질, 기능의 손실, 계란, 배아, 다양한 생물 1-7의 세포로 기능 시약, 염료 및 그 조합의 이득 등의 다양한 트리트먼트를 제공하는 강력한 기술이다. 미세 주입 실험을 설계 할 경우에는 몇 가지 고려 사항을 염두에 보관해야합니다.
그것은 전달 처리 및 주입량의 용해성을 고려하는 것이 중요하다. 미세 주입 용액은 심지어 약간 침전?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 촬영 지원을위한 원고와 베티 Cowgill의 중요한 읽기 산티아고 레즈 감사합니다. 우리는 또한 자신의 중요한 의견을 익명의 검토를 부탁드립니다. 이 작품은 델라웨어 대학의 연구 기금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Glass pasteur pipettes | VWR | 14673-043 | |
| Inverted microscope Axiovert 40C | Zeiss | 4109431007990000 | Injection microscope |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | Load injection solution |
| Nylon filter mesh 80 μm | Amazon.com | 03-80-37 | Filter eggs to get rid of debris |
| P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips | Fisher Scientific | 02707432 or 02707430 | Part of a mouth pipette |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13 374 12 | Part of a mouth pipette |
| Polyethylene tubing | Intramedic | PE-160 | Part of a mouth pipette |
| Protamine sulfate | MP Biomedicals, LLC | 194729 | Attach dejellied eggs to injection dishes |
| Sea urchins S. purpuratus | Pt. Loma Marine Invertebrate Lab | N/A | |
| Sea water | any pet store | Instant Ocean | |
| Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | Injection dishes |
| Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1 | Narishige | 9124 | Manipulate injection needle |
| Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND | Narishige | 9212 | Manipulate injection needle |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Vertical needle puller | Narishige | PC-10 | Pull injection needles |
References
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