Высокая пропускная Микроинъекции из морского ежа зиготы
Summary
Микроинъекция является общим методом, используемым для доставки конструкций ДНК, мРНК, морфолино антисмысловых олигонуклеотидов или другие процедуры в яиц, эмбрионов и клеток различных видов.
Abstract
Микроинъекции в клетки и эмбрионы в является общим методом, который используется для изучения широкий спектр биологических процессов. В этом методе небольшое количество обрабатывающего раствора загружают в микроинъекции иглы, используемой для физически вводить индивидуальные иммобилизованных клеток или эмбрионов. Несмотря на необходимость первоначального обучения для выполнения этой процедуры для доставки высокой пропускной, микроинъекции обеспечивает максимальную эффективность и воспроизводимую доставку широкого спектра лечебных решений (в том числе сложных смесей образцов) в клетки, яйца или эмбрионы. Приложения к микроинъекций включают доставку конструкций ДНК, мРНК, рекомбинантных белков, усиления функции и потери функциональных реагентов. Флуоресцентный краситель или колориметрический добавляется введенного раствора, чтобы позволить мгновенную визуализацию эффективной доставки, а также средство для надежного нормализации количества подаваемого раствора. Описанный способ позволяет микроинъекции 100-400 морского ежа гygotes пределах 10-15 мин.
Introduction
Эффективное и воспроизводимое доставка лечение является одним из основных методологических проблем для исследователей. Некоторые методы были созданы для временно поставлять решения по лечению в яйца, эмбрионов и клеток. Эти методы включают электропорации (на основе генерирующих переходных пор в мембране с помощью коротких электрических импульсов) 1,2, липофекция (доставка путем слияния лечения, содержащих липосомы с мембраной) 1, бомбардировки микрочастицами 1 (ДНК осаждают на микрон размеров металлических частиц, которые затем используются для проникновения в клетки с высокой скоростью), и трансдукции (вирус используют в качестве средства доставки трансгенов). На данный момент, микроинъекции единственный подход, который держит преимущество доставки любого решения с 100%-ной эффективности с минимальными реагентов. Кроме того, один инъекционный раствор может состоять из сложного коктейль из обработок. Этот метод был использован для успешнойлы microinject яйца и эмбрионы из многочисленных видов, таких как морские ежи 3,4, зебры рыбы 5, мыши 6, лягушки 7, и крупного рогатого скота 8, а также отдельных клеток в культуре ткани 9. Холост бластомеров инъекции в более поздних стадиях развития также были проведены 10-12.
Современные методы микроинъекции основаны на методе давления впрыска, который был первоначально описываемой Hiramoto 10, однако, большой прогресс был достигнут в направлении оптимизации этого процесса. Отличные методы микроинъекции были описаны в других 11, и здесь мы описали один из специфических методов, которые в настоящее время используются для microinject морского ежа (Strongylocentrotus purpuratus) недавно оплодотворенных яйцеклеток. Более века, морские ежи были ценным экспериментальная модель 15,16. Морские ежи эволюционно тесно связаны с хордовых (включая нас) и анализаих геном показал, что они содержат все основные семейств генов, как человека 17. Они производят большое количество синхронно разработки прозрачных эмбрионов, которые можно легко манипулировать. Использование морского ежа в качестве модельного организма, морской еж сообщество внесло свой вклад в наше понимание процесса оплодотворения 18-21, биологических процессов клеточных 22-24 и генных регуляторных сетей (GRNs) 25-28.
Микроинъекция в морских ежей зиготы требует нескольких шагов. Во-первых, яйца должны быть иммобилизованы до инъекции (см. ниже). Микроинъекция блюда покрыты сульфат протамина (PS), который создает положительно заряженную поверхность, к которой отрицательно заряженные яйца могут прилипать 3. Яйца dejellied путем инкубации в кислой морской воды (рН 5,15) в течение 10 мин, с последующими двумя промывками в натуральной морской воде или искусственной морской воды (рН 8,0). В dejellied яйца тщательно гребли по прямойв середине покрытого PS-Петри в присутствии 1 мМ 3-аминотриазола (3-AT), который необходим, чтобы ингибировать активность ovoperoxidase, который секретируется из корковых гранул яйца в результате оплодотворения 29. Этот шаг важен, чтобы предотвратить затвердевание оболочки оплодотворения и для облегчения ввода микроинъекции иглы. В качестве альтернативы 1 мМ 3-АТ, 10 мМ paraminobenzoic кислоты (PABA) могут быть использованы. Инъекционный раствор загружают в микроинъекции иглы с использованием специализированного наконечник пипетки microloading и установлен на держателе, прикрепленной к микроманипулятором и блок давления (рис. 1). Каждая игла может быть использован для microinject отдельные зиготы в нескольких экспериментах на отдельные дни. Микроинъекция может быть выполнена в течение 10-15 мин, пока не затвердеет зиготы. В зиготы затем промывают с морской водой и культивировали при 15 ° С Когда эмбрионы достигают вылупления бластулы этап, они выпускают штриховки фермент, который расщепляет компоненты ферtilization конверт 30 и позволить им естественно оторваться от тарелки ПС-покрытием. Если необходимо, эмбрионы могут быть осторожно отделена от тарелки с помощью рот пипеткой или пипетки Пастера, осторожно дует морской воды на эмбрионов. Описанный способ позволяет эффективную и надежную микроинъекции 100-400 недавно оплодотворенных яиц на одном блюде, предоставляя метод высокой пропускной ниже по течению анализов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Микроинъекция является мощным средством для доставки различных процедур, таких как ДНК, РНК, рекомбинантных белков, потеря функции и увеличение функциональных реагентов, красителей и их комбинаций в яйца, эмбрионов и клеток различных организмов 1-7. Тем не менее, несколько сообра?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Сантьяго Суарес за критическое прочтение рукописи и Бетти Cowgill для помощи в фотографии. Мы также благодарим анонимных рецензентов за их критической обратной связи. Эта работа проводится при поддержке Университета штата Делавэр исследовательского фонда.
Materials
| Glass pasteur pipettes | VWR | 14673-043 | |
| Inverted microscope Axiovert 40C | Zeiss | 4109431007990000 | Injection microscope |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | Load injection solution |
| Nylon filter mesh 80 μm | Amazon.com | 03-80-37 | Filter eggs to get rid of debris |
| P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips | Fisher Scientific | 02707432 or 02707430 | Part of a mouth pipette |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13 374 12 | Part of a mouth pipette |
| Polyethylene tubing | Intramedic | PE-160 | Part of a mouth pipette |
| Protamine sulfate | MP Biomedicals, LLC | 194729 | Attach dejellied eggs to injection dishes |
| Sea urchins S. purpuratus | Pt. Loma Marine Invertebrate Lab | N/A | |
| Sea water | any pet store | Instant Ocean | |
| Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | Injection dishes |
| Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1 | Narishige | 9124 | Manipulate injection needle |
| Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND | Narishige | 9212 | Manipulate injection needle |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Vertical needle puller | Narishige | PC-10 | Pull injection needles |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys.Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Peng, H., Wu, Y. Y., Zhang, Y. Efficient Delivery of DNA and Morpholinos into Mouse Preimplantation Embryos by Electroporation. Plos One. 7, 13 (2012).
- Ettensohn, C. A., Wray, G. A., Wessel, G. M. . eds. Development of sea urchins, ascidians, and other invertebrate deuterostomes: experimental approaches. 74, (2004).
- Franks, R. R., Houghevans, B. R., Britten, R. J., Davidson, E. H. Direct introduction of cloned DNA into the sea urchin zygote nucleus, and fate of injected DNA. Development. 102, 287-299 (1988).
- Kinsey, W. H. Analysis of signaling pathways in zebrafish development by microinjection. Methods Mol. Biol. 518, 67-76 (2009).
- Kola, I., Sumarsono, S. H. Microinjection of in vitro transcribed RNA and antisense oligonucleotides in mouse oocytes and early embryos to study the gain- and loss-of-function of genes. Mol. Biotechnol. 6, 191-199 (1996).
- Mishina, T., Fuchimukai, K., Igarashi, K., Tashiro, K., Shiokawa, K. Modification of secondary head-forming activity of microinjected a dagger beta-catenin mRNA by co-injected spermine and spermidine in Xenopus early embryos. Amino Acids. 42, 791-801 (2012).
- O’Meara, C. M., et al. Gene silencing in bovine zygotes: siRNA transfection versus microinjection. Reprod. Fertil. Dev. 23, 534-543 (2011).
- Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. Nonviral gene delivery. Cold Spring Harb. Protoc. , (2011).
- Hiramoto, Y. Cell division without mitotic apparatus in sea urchin eggs. Exp. Cell Res. 11, 630-636 (1956).
- Wilson, L. . Methods in Cell Biology. 25, (1982).
- Gross, J. M., McClay, D. R. The role of Brachyury (T) during gastrulation movements in the sea urchin Lytechinus variegatus. Dev. Biol. 239, 132-147 (2001).
- Yajima M, W. G. Autonomy in specification of primordial germ cells and their passive translocation in the sea urchin. Development. 139, 3786-3794 (2012).
- Duboc, V., et al. Nodal and BMP2/4 pattern the mesoderm and endoderm during development of the sea urchin embryo. Development. 137, 223-235 (2010).
- Ernst, S. G. Offerings from an Urchin. Dev. Biol. 358, 285-294 (2011).
- McClay, D. R. Evolutionary crossroads in developmental biology: sea urchins. Development. 138, 2639-2648 (2011).
- Sodergren, E., et al. Research article – The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
- Roux, M. M., et al. A functional genomic and proteomic perspective of sea urchin calcium signaling and egg activation. Dev. Biol. 300, 416-433 (2006).
- Turner, P. R., Sheetz, M. P., Jaffe, L. A. Fertilization increases the polyphosphoinositide content of sea urchin eggs. Nature. 310, 414-415 (1984).
- Voronina, E., Marzluff, W. F., Wessel, G. M. Cyclin B synthesis is required for sea urchin oocyte maturation. Dev. Biol. 256, 258-275 (2003).
- Wong, J. L., Wessel, G. M. Extracellular matrix modifications at fertilization: regulation of dityrosine crosslinking by transamidation. Development. 136, 1835-1847 (2009).
- Shuster, C. B., Burgess, D. R. Transitions regulating the timing of cytokinesis in embryonic cells. Curr. Biol. 12, 854-858 (2002).
- Morris, R. L., et al. Analysis of cytoskeletal and motility proteins in the sea urchin genome assembly. Dev. Biol. 300, 219-237 (2006).
- Minc, N., Burgess, D., Chang, F. Influence of Cell Geometry on Division-Plane Positioning. Cell. 144, 414-426 (2011).
- Davidson, E. H., et al. A genomic regulatory network for development. Science. 295, 1669-1678 (2002).
- Oliveri, P., Tu, Q., Davidson, E. H. Global regulatory logic for specification of an embryonic cell lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5955-5962 (2008).
- Peter, I. S., Davidson, E. H. A gene regulatory network controlling the embryonic specification of endoderm. Nature. 474, (2011).
- Nam, J. M., Dong, P., Tarpine, R., Istrail, S., Davidson, E. H. Functional cis-regulatory genomics for systems biology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3930-3935 (2010).
- Showman, R. M., Foerder, C. A. Removal of the fertilization membrane of sea-urchin embryos employing aminotriazole. Exp. Cell Res. 120, 253-255 (1979).
- Lepage, T., Sardet, C., Gache, C. Spatial expression of the hatching enzyme gene in the sea-urchin embryo. Dev. Biol. 150, 23-32 (1992).
- Jaffe, L. A., Terasaki, M. Quantitative microinjection of oocytes, eggs, and embryos. Development of Sea Urchins, Ascidians, and Other Invertebrate Deuterostomes: Experimental Approaches. 74, 219-242 (2004).
