Hög genomströmning microinjections av Sea Urchin Zygotes

Summary

Mikroinjektion är en vanlig teknik som används för att leverera DNA-konstruktioner, mRNAs, morfolino antisensoligonukleotider eller andra behandlingar in i ägg, embryon, och celler från olika arter.

Abstract

Mikroinjektion in i celler och embryon är en vanlig teknik som används för att studera en mängd olika biologiska processer. I denna metod en liten mängd behandlingslösning laddas i en mikroinjektion nål som används för att fysiskt injicera enskilda immobiliserade celler eller embryon. Trots behovet av grundutbildning för att utföra den här proceduren för hög genomströmning leverans, erbjuder mikroinjektion maximal effektivitet och reproducerbar leverans av ett brett utbud av behandlingslösningar (inklusive komplexa blandningar av prover) i celler, ägg eller embryon. Ansökan till microinjections omfattar leverans av DNA-konstruktioner, mRNA, rekombinanta proteiner, vinst på funktion, och förlust av funktions reagenser. Lysrör eller kolorimetrisk färgämne tillsätts till den injicerade lösningen för att möjliggöra omedelbar visualisering av effektiv leverans samt verktyg för tillförlitlig normalisering av beloppet för den levererade lösningen. Den beskrivna metoden möjliggör mikroinjektion 100-400 sjöborre zygotes inom 10-15 min.

Introduction

Effektiv och reproducerbar behandling leverans är en av de viktigaste metodologiska utmaningarna för forskare. Flera metoder har inrättats för att tillfälligt leverera behandlingslösningar i ägg, embryon och celler. Dessa metoder innefattar elektroporering (baserad på en genererande transienta porer i membranet med användning av korta elektriska pulser) ^1,2, lipofektion (leveranstid genom fusion av behandling-innehållande liposomer med membranet) ^1, mikropartikelbombardemang ¹ (DNA utfälles på mikron stora metallpartiklar som sedan används för att tränga in i celler vid hög hastighet), och transduktion (viruset används som en tillförselvehikel av transgener). Just nu är mikroinjektion den enda metod som håller fördelen av att leverera en lösning med 100% effektivitet med minimal reagenser. Vidare kan en enda injektion lösning vara sammansatt av en komplex blandning av behandlingar. Denna teknik har använts för att framgångsriktly mikroinjicera ägg och embryon från många arter såsom sjöborrar ^3,4, zebrafisk ^5, mus ^6, groda ^7, och nötkreatur ⁸ samt enstaka celler i vävnadskultur ^9. Enstaka blastomeres injektioner vid senare utvecklingsstadier har också genomförts ^10-12.

De nuvarande metoderna för microinjections är baserade på tryckinjektionsmetod som ursprungligen beskrevs av Hiramoto ^10, men har stora framsteg gjorts mot optimering av processen. Utmärkta mikroinjektion tekniker har beskrivits på annan plats ^11, och här beskriver vi ett av de specifika metoder som idag används för att mikroinjicera sjöborre (Strongylocentrotus purpuratus) nyligen befruktade ägg. I över ett sekel har sjöborrar varit en värdefull experimentell modell ^15,16. Sjöborrar är evolutionärt nära besläktade med chordates (inklusive oss) och analys avderas genom avslöjade att de innehåller alla de stora genfamiljer som det mänskliga ^17. De producerar ett stort antal synkront utveckla transparenta embryon som lätt kan manipuleras. Använda sjöborre som modellorganism har sjöborre samfundet bidragit till vår förståelse av gödsling processen ^18-21, cellbiologiska processer ^22-24, och genen regleringsnät (GRNs) ^25-28.

Mikroinjektion i sjöborre zygotes kräver flera steg. Först äggen behöver immobiliseras före injektioner (beskrivs nedan). Mikroinjektion rätter är belagda med protaminsulfat (PS), som skapar en positivt laddad yta vid vilken de negativt laddade ägg kan vidhäfta ^3. Äggen dejellied genom inkubering i surt havsvatten (pH 5,15) under 10 min, följt av två tvättningar i naturligt havsvatten eller artificiellt havsvatten (pH 8,0). De dejellied äggen försiktigt rodde i en rak linjei mitten av PS belagda skålen i närvaro av 1 mM 3-aminotriazol (3-AT), som krävs för att inhibera aktiviteten av ovoperoxidase som utsöndras från kortikala granuler av ägg som ett resultat av befruktning ^29. Detta steg är viktigt för att förhindra härdning av gödsling kuvertet och för att underlätta mikroinjektion nål posten. Som ett alternativ till ett mM 3-AT, kan 10 mM paraminobenzoic syra (PABA) användas. Injektionslösningen laddas i en mikroinjektion nålen med hjälp av specialiserad microloading pipettspetsen och monterade på en hållare fäst till mikromanipulator och tryckenhet (figur 1). Varje nål kan användas för att mikroinjicera enskilda zygoter i flera experiment på separata dagar. Mikroinjektion kan utföras efter 10-15 min tills zygoter hårdna. De zygoter tvättas sedan med havsvatten och odlades vid 15 ° C. När embryona når kläckning blastula skede, de släpper kläckning enzym som smälter komponenter i fertilization kuvertet ³⁰ och tillåta dem att naturligt lossna från PS-belagda skålen. Vid behov kan embryona försiktigt loss från skålen genom att använda en mun pipett eller pasteurpipett genom att försiktigt blåsa havsvatten på embryona. Den beskrivna metoden möjliggör effektiv och tillförlitlig mikroinjektion av 100-400 nyligen befruktade ägg på en enda maträtt, som ger en hög genomströmning metod för analyser i senare led.

Protocol

1. Beredning av protaminsulfat (PS) Bestruket Rätter Bered en% lösning av protaminsulfat (PS) genom att tillsätta 0,5 g av PS till 50 ml avjoniserat, destillerat vatten (DDH 2 O) i ett 50 ml koniskt rör. Skaka väl i hög hastighet på en bänk skakapparat vid rumstemperatur i 1-2 timmar för att säkerställa fullständig upplösning av PS. Denna lösning kan förvaras vid 4 ° C i minst tre månader (se till att fullständigt upplösa gelliknande fällning före varje användning) 3.</su…

Representative Results

GFP och mCherry reporterkonstruktioner var in vitro-transkriberat och mikroinjiceras in i de nyligen befruktade ägg. Embryon inkuberades vid 15 ° C under 24 h (tills blastula steget) och avbildas med Zeiss Observer Z1 mikroskop. Injektion av reporterkonstruktioner ledde inte till några utvecklingsdefekter (Figur 6). För kvantifiering av fluorescerande signaler, var bildinhämtning utförs vid låg förstoring (100X) för att maximalt fånga fluorescerande pixlar (fig. 6D-F).</strong…

Discussion

Mikroinjektion är en kraftfull teknik för att avge olika behandlingar, såsom DNA, mRNA, rekombinanta proteiner, förlust av funktion och funktionsökning reagens, färgämnen och kombinationer av dessa in i ägg, embryon, och celler av olika organismer ^1-7. Dock bör flera faktorer hållas i åtanke när man utformar en mikroinjektion experiment.

Det är oerhört viktigt att beakta lösligheten hos den levererade behandlingen och injektionsvolymen. Om idag injiceras lösningen …

Materials

Glass pasteur pipettes	VWR	14673-043
Inverted microscope Axiovert 40C	Zeiss	4109431007990000	Injection microscope
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003	Load injection solution
Nylon filter mesh 80 μm	Amazon.com	03-80-37	Filter eggs to get rid of debris
P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips	Fisher Scientific	02707432 or 02707430	Part of a mouth pipette
Parafilm	Fisher Scientific	13 374 12	Part of a mouth pipette
Polyethylene tubing	Intramedic	PE-160	Part of a mouth pipette
Protamine sulfate	MP Biomedicals, LLC	194729	Attach dejellied eggs to injection dishes
Sea urchins S. purpuratus	Pt. Loma Marine Invertebrate Lab	N/A
Sea water	any pet store	Instant Ocean
Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish	Fisher Scientific	0875713A	Injection dishes
Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1	Narishige	9124	Manipulate injection needle
Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND	Narishige	9212	Manipulate injection needle
Transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM
Vertical needle puller	Narishige	PC-10	Pull injection needles