High Throughput microinyecciones de Sea Urchin cigotos
Summary
La microinyección es una técnica común que se utiliza para entregar construcciones de ADN, ARNm, oligonucleótidos antisentido morfolino u otros tratamientos en los huevos, embriones y células de diversas especies.
Abstract
La microinyección en células y embriones es una técnica común que se utiliza para estudiar una amplia gama de procesos biológicos. En este método, una pequeña cantidad de solución de tratamiento se carga en una aguja de microinyección que se utiliza para inyectar físicamente células o embriones individuales inmovilizadas. A pesar de la necesidad de una formación inicial para realizar este procedimiento para la entrega de alto rendimiento, la microinyección ofrece la máxima eficiencia y la entrega reproducible de una amplia variedad de soluciones de tratamiento (incluyendo mezclas complejas de muestras) en las células, los óvulos o embriones. Aplicaciones a las microinyecciones incluyen la entrega de las construcciones de ADN, ARNm, proteínas recombinantes, ganancia de función, y la pérdida de función de los reactivos. Colorante fluorescente o colorimétrico se añade a la solución inyectada para permitir la visualización inmediata de la entrega eficiente, así como una herramienta fiable para la normalización de la cantidad de la solución entregada. El método descrito permite la microinyección de 100-400 erizo de mar zygotes dentro de 10 a 15 min.
Introduction
La aplicación del tratamiento eficiente y reproducible es uno de los principales desafíos metodológicos para los investigadores. Varios métodos han sido establecidos para ofrecer soluciones de tratamiento de forma transitoria en los huevos, embriones y células. Estos métodos incluyen la electroporación (basado en una generación de poros transitorios en la membrana utilizando pulsos eléctricos cortos) 1,2, lipofección (entrega a través de la fusión de liposomas que contiene el tratamiento con la membrana) 1, bombardeo de micropartículas 1 (ADN se precipita en la micrones partículas de tamaño de metal que luego se utilizan para penetrar en las células a alta velocidad), y la transducción (virus se usa como un vehículo de entrega de transgenes). Por el momento, la microinyección es el único enfoque que tiene la ventaja de entregar cualquier solución con una eficiencia del 100% con un mínimo de reactivos. Por otra parte, una solución de inyección única puede estar compuesto de un complejo cóctel de tratamientos. Esta técnica se ha utilizado con éxito paraLY microinject los huevos y embriones a partir de numerosas especies tales como erizos de mar 3,4, pez cebra 5, 6 del ratón, rana 7, 8 y ganado así como células individuales en el cultivo de tejido 9. Blastómeros individuales inyecciones en las etapas de desarrollo posteriores también se han llevado a cabo 10-12.
Los métodos actuales de microinyecciones se basan en el método de presión de inyección que fue descrito inicialmente por Hiramoto 10, sin embargo, se ha hecho un gran progreso hacia la optimización de este proceso. Excelentes técnicas de microinyección se han descrito en otra parte 11, y aquí estamos describir uno de los métodos específicos que se utilizan actualmente para microinyectar erizo de mar (Strongylocentrotus purpuratus) los huevos recién fertilizados. Durante más de un siglo, los erizos de mar han sido un valioso modelo de 15,16 experimental. Los erizos de mar están estrechamente relacionados evolutivamente a cordados (incluyéndonos a nosotros) y el análisis desu genoma reveló que contienen todas las grandes familias de genes como el 17 humano. Ellos producen un gran número de desarrollar sincrónicamente embriones transparentes que pueden ser fácilmente manipulados. El uso de erizo de mar como un organismo modelo, la comunidad de erizo de mar ha contribuido a nuestra comprensión del proceso de la fecundación 18-21, procesos biológicos celulares 22-24, y las redes reguladoras de genes (GRN) 25-28.
Microinyección en cigotos de erizo de mar requiere de varios pasos. En primer lugar, los huevos deben ser inmovilizada antes de las inyecciones (descrito a continuación). Platos de microinyección se recubren con sulfato de protamina (PS), que crea una superficie cargada positivamente a la que los huevos cargados negativamente pueden adherirse 3. Los huevos se dejellied por incubación en agua de mar ácida (pH 5,15) durante 10 min, seguido por dos lavados en agua de mar natural o agua de mar artificial (pH 8,0). Los huevos son cuidadosamente dejellied remaron en línea rectaen el medio del plato recubierto de PS en la presencia de 1 mM de 3-aminotriazol (3-AT), que se requiere para inhibir la actividad de ovoperoxidase que es secretada a partir de los gránulos corticales del huevo como un resultado de la fertilización 29. Este paso es importante para evitar el endurecimiento de la envolvente de la fertilización y para facilitar la entrada de la aguja de microinyección. Como una alternativa a 1 mM de 3-AT, 10 mM de ácido paraminobenzoic (PABA) se puede utilizar. La solución de inyección se carga en una aguja de microinyección usando la punta de la pipeta especializada microloading y montado sobre un soporte unido a micromanipulador y unidad de presión (Figura 1). Cada aguja se puede utilizar para microinyectar cigotos individuales en múltiples experimentos en días separados. La microinyección se puede realizar durante 10-15 minutos hasta que los cigotos se endurecen. Los cigotos se lavan a continuación con el agua de mar y se cultivaron a 15 ° C. Cuando los embriones alcanzan la eclosión blástula etapa, que la liberación de enzima que digiere la eclosión componentes de la FERdotación tilización 30 y les permiten desprenden naturalmente del plato recubierto-PS. Si es necesario, los embriones se pueden separar suavemente de la cápsula, utilizando una pipeta de boca o pipeta Pasteur soplando suavemente el agua de mar en los embriones. El método descrito permite la microinyección eficiente y fiable de 100-400 huevos recién fertilizados en un solo plato, proporcionar un método de alto rendimiento para el análisis aguas abajo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La microinyección es una técnica poderosa para la entrega de diversos tratamientos, tales como ADN, ARNm, proteínas recombinantes, pérdida de la función y la ganancia de función de reactivos, colorantes y sus combinaciones en huevos, embriones y células de diversos organismos 1-7. Sin embargo, varias consideraciones deben ser tenidas en cuenta al diseñar un experimento de microinyección.
Es sumamente importante tener en cuenta la solubilidad del tratamiento administrado y…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Santiago Suarez para la lectura crítica del manuscrito y Betty Cowgill para la ayuda en la fotografía. También agradecemos a los revisores anónimos por sus comentarios críticos. Este trabajo es apoyado por la Universidad de Delaware Fondo de Investigación.
Materials
| Glass pasteur pipettes | VWR | 14673-043 | |
| Inverted microscope Axiovert 40C | Zeiss | 4109431007990000 | Injection microscope |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | Load injection solution |
| Nylon filter mesh 80 μm | Amazon.com | 03-80-37 | Filter eggs to get rid of debris |
| P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips | Fisher Scientific | 02707432 or 02707430 | Part of a mouth pipette |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13 374 12 | Part of a mouth pipette |
| Polyethylene tubing | Intramedic | PE-160 | Part of a mouth pipette |
| Protamine sulfate | MP Biomedicals, LLC | 194729 | Attach dejellied eggs to injection dishes |
| Sea urchins S. purpuratus | Pt. Loma Marine Invertebrate Lab | N/A | |
| Sea water | any pet store | Instant Ocean | |
| Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | Injection dishes |
| Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1 | Narishige | 9124 | Manipulate injection needle |
| Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND | Narishige | 9212 | Manipulate injection needle |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Vertical needle puller | Narishige | PC-10 | Pull injection needles |
References
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