근육 위성 세포의 분리, 문화, 및 이식
Summary
정지 위성 세포의 순수 인구의 분리 및 배양은 근육 줄기 세포 집단은 근육 줄기 세포 생물학 및 재생뿐만 아니라, 근육 퇴행 위축 및 기타 퇴행성 질환의 치료를위한 줄기 세포 이식의 이해에 중요하다.
Abstract
근육 위성 세포는 근육 섬유에 sublaminal 핵 2 ~ 5 %를 차지, 출생 후의 골격 근육 발달 및 재생에 필요한 줄기 세포 집단이다. 성인 근육 위성 세포는 일반적으로 mitotically 정지합니다. 손상 후, 그러나, 위성 세포는 근육의 재생을 중재하는 아세포, 그들의 자손을 생산하는 세포 증식을 시작. 위성 세포 유래 근육 모세포 이식 널리 근육 영양 장애, 심장 마비, 및 비뇨 장애 등 여러 가지 재생 질환에 대한 가능한 치료로 연구되고있다. 이영 골격 근육, 심장 경색 및 dysfunctioning 요도 관에 근 모세포 이식 접목 근원 세포가 호스트 조직에서 근육 섬유로 분화 및 이러한 질병에 부분적인 기능 개선을 표시 할 수있는 것으로 나타났습니다. 따라서 골격 muscl에서 정지 위성 세포의 효율적인 정제 방법의 개발전자뿐만 아니라 위성 세포 유래 근원 세포 배양 및 근육 아세포를위한 이식 방법의 확립으로, 위성 세포의자가 재생, 활성화, 차별화 뒤에 분자 메커니즘을 이해하는 데 필수적이다. 또한, 근육의 영양 장애 및 기타 재생 질환에 대한 세포 기반 치료법의 개발은 이러한 요인에 따라 달라집니다.
그러나, 정지 위성 세포의 현재 장래 정제 방법은 고가의 형광 – 활성 세포 선별 (FACS) 기계의 사용을 필요로한다. 여기, 우리는 (MACS)를 정렬 자기 활성화 된 셀 다음에 효소 분해에 의해 성인 마우스 골격 근육에서 정지 위성 세포의 급속한 경제적이고 신뢰할 수있는 정제를위한 새로운 방법을 제시한다. 순수한 정지 위성 세포의 분리 후,이 세포는 여러 통로 후에 근육 아세포 다수 구하는 배양 될 수있다. 이 갓 고립정지 위성 세포 또는 생체 확장 아세포는 cardiotoxin에 이식 할 수있다 (CTX) 근육 섬유 재생에 기증자 유래 세포의 기여를 검사하는 마우스 골격 근육을 재생 유도뿐만 아니라 자기 갱신의 시험 위성 세포 구획에 활동.
Introduction
근육 위성 세포가 골격근 섬유의 기저판 아래에 위치한 근육 조직 줄기 세포의 작은 집단이다. 그들은 Pax7, PAX3, C-메트, M-cadherin의, CD34, Syndecan-3의 발현을 특징으로하고, 칼시토닌 1된다 – 3. 위성 세포는 근육 줄기 세포로 근육의 재생을위한 책임을 입증했다. 성인 근육 위성 세포는 4-8 일반적으로 mitotically 정지합니다. 손상 후, 위성 세포가 MyoD 발현을 개시하고, 그 자손을 확장 세포주기를 입력, 활성화, 근육 조직 전구체 세포 또는 근육 아세포 3 칭했다. 세포 분열 몇 차례 한 후, 근육 아세포는 성숙한 근육 섬유 이어 멀티 핵 myotubes로 차별화를 받아야하기 위해 각각의 다른 세포주기 및 퓨즈를 종료합니다. 성인 근육에서 분리 된 근육 아세포는 쉽게 생체 확장 할 수 있습니다. 근육 재생과에 근육 섬유가 될 수 아세포의 용량nonmuscle 조직의 형태 자궁외 근육 섬유의 근 모세포 이식, Duchenne 근육 퇴행 위축 (DMD) 4에 대한 잠재적 인 치료 방법, 비뇨기 장애 (9), 심장 마비 (10)에 의해 이용된다. 사실, 근육 아세포는 성공적으로 모두 MDX (DMD 모델) 마우스와 DMD 환자의 11 ~ 14의 근육에 이식되었다. 주입 된 정상 근원 세포는 병에 걸린 근육의 조직 학적 및 기능 향상을 위해 호스트 근육 섬유와 융합. 이전 작업은 근육 아세포의 모집단이 더 세포와 같은 줄기 근육 재생 5시 근육에 이상 미분화 상태로 유지하는 것을 보여 주었다. 최근 작품은 성인 근육 갓 고립 된 위성 세포는 근육 5-8 재생에보다 효율적으로 생착과 자기 갱신의 활동을 나타내는 줄기 세포와 같은 인구를 포함하는 것으로 나타났습니다. 따라서 성인 골격 MU로부터 정지 위성 세포의 순수 인구 정화용scle는 위성 세포, 근육 아세포와 근육 재생의 생물학을 이해하고, 세포 기반 치료법의 개발을 위해 필수적이다.
그러나, 정지 위성 세포의 현재 장래 정제 방법은 고가의 형광 – 활성 세포 선별 (FACS) 기계 1,2,6-8의 사용을 필요로한다. 또, FACS 레이저 노광 정지 위성 세포 (15)의 낮은 수율로 인해 분리시 세포 사멸을 유도하는 경향이있다. 여기, 우리는 성인 마우스 골격 근육에서 정지 위성 세포의 급속한 경제적이고 신뢰할 수있는 정제를위한 새로운 방법을 제시한다. 이 방법은 (MACS)를 정렬 자기 활성화 된 셀 다음에 효소 분해를 이용한다. 순수한 정지 위성 세포의 분리 후,이 세포는 여러 통로 후에 근육 아세포 다수 구하는 배양 될 수있다. 우리는 또한 보여 이들 갓 고립 된 정지 위성 세포 또는 전 VI의 근육 내 주사할머니 확장 아세포가 cardiotoxin에 이식 할 수있다 (CTX) 근육 섬유뿐만 아니라 자기 갱신 활동의 시험 위성 세포 구획에 재생에 기증자 유래 세포의 기여를 검사하는 마우스 골격 근육을 재생 유도.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서, 정지 위성 세포 간단 콜라게나 제 소화 표면 항체 – 매개 MACS 분리에 의해 생쥐의 성인 골격근으로부터 정제 될 수있다. 이 방법은 약 6 시간 소요하고 FACS 기계와 같은 고가의 장비를 필요로하지 않는다. 또한,이 방법은 표면 항체 – 매개 FACS 분리에 비해 상대적으로 저렴합니다. FACS 레이저 노출은 분리 중에 15 세포 죽음을 유도하는 경향이 이후 정지 위성 세포의 높은 수?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 Myf5 + / nLacZ 마우스를 제공하기 위해 박사 Shahragim Tajbakhsh 감사합니다. 우리는 또한이 원고의 중요한 읽기 알렉산더 Hron 마이클 Baumrucker 감사합니다. 이 작품은 근육질 영양 장애 협회 (MDA)와 그레고리 Marzolf 주니어 MD 센터 대상에서 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Materials | |||
| Collagenase Type 2 | Worthington | CLS-2 | 100 mg |
| Marigel | BD Biosciences | 356234 | 5 ml |
| DMEM | Gibco-Invitrogen | 10569010 | 500 ml |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | 100 mg (3-4 mg/ml) |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | 500 ml |
| bFGF, human, Recombinant | Gibco-Invitrogen | PHG0263 | 1 mg |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A5611-1G | 1 g |
| Ham’s F10 Medium | Gibco-Invitrogen | 11550-043 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 3600511 | 500 ml |
| Horse Serum | Gibco-Invitrogen | 26050088 | 500 ml |
| Penicillin/Streptmycin | Gibco-Invitrogen | 15640055 | 100 ml |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco-Invitrogen | 14190144 | 500 ml |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco-Invitrogen | 25200072 | 500 ml |
| 18G needle with 12cc Syringe | Fisher Scientific | 22-256-563 | |
| Cell strainer (70 μm) | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Falcon 50 ml tube | BD Biosciences | 352098 | |
| Falcon 15 ml tube | BD Biosciences | 352097 | |
| 10 cm tissue culture plate | BD Biosciences | 353003 | |
| 6 cm tissue culture plate | BD Biosciences | 353004 | |
| Falcon 10 ml disposable pipet | BD Biosciences | 357551 | |
| Anti-CD31 antibody-PE | eBiosciences | 12-0311 | |
| Anti-CD45 antibody-PE | eBiosciences | 30-F11 | |
| Anti-Sca1 antibody-PE | eBiosciences | Dec-81 | |
| Anti-Integrin α7 antibody | MBL International | ABIN487462 | |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-Mouse IgG MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-402 | |
| Mini & MidiMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-632 | |
| MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| LD Column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Cardiotoxin | Sigma Aldrich | C9759-1MG | Stock 10 μM in PBS |
| 31G Insulin syringe | BD Biosciences | 328438 | |
| Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R) | Beckman Coulter | 368826 | |
| S241.5 Swinging Bucket Rotor | Beckman Coulter | 368882 | |
| Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R) | Beckman Coulter | 392187 | |
| Nod/Scid immunodeficient mice | Charles River Laboratories | Strain Code 394 | Use 2 months old mice |
| Reagents | |||
| Name of the reagent | Recipie | ||
| 10% and 2% FBS DMEM | DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 0.2% Collagenase solution | Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM. | ||
| 10% Matrigel solution | Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20°C until use. | ||
| Matrigel-coated plate | Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temprature for 1 minutes. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37°C for 30 minute after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 minutes. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20°C for reusing. | ||
| 0.01% Collagen solution | Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O. | ||
| Collagen-coated plate | Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months. | ||
| bFGF stock solution | bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80°C. | ||
| Myoblast medium | 500 mL HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock). | ||
| Differentiation medium | 500 mL DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 10 μM Cardiotoxin stock | 1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS. |
References
- Fukada, S., et al. Purification and cell-surface marker characterization of quiescent satellite cells from murine skeletal muscle by a novel monoclonal antibody. Exp. Cell Res. 296, 245-255 (2004).
- Hirai, H., Verma, M., Watanabe, S. C. T., Asakura, Y., Asakura, A. MyoD regulates apoptosis of myoblasts through microRNA-mediated down-regulation of Pax3. J. Cell Biol. (191), 347-365 (2010).
- Asakura, A. Stem cells in adult skeletal muscle. Trends Cardiovasc. Med. 13, 123-128 (2003).
- Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
- Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122, 289-301 (2005).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309, 2064-2067 (2005).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456, 502-506 (2008).
- Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods Mol. Biol. 621, 165-173 (2010).
- Yokoyama, T., Huard, J., Chancellor, M. B. Myoblast therapy for stress urinary incontinence and bladder dysfunction. World J. Urol. 18, 56-61 (2000).
- Menasche, P. Skeletal muscle satellite cell transplantation. Cardiovasc. Res. 58, 351-357 (2000).
- Huard, J., et al. Myoblast transplantation produced dystrophin-positive muscle fibres in a 16-year-old patient with Duchenne muscular dystrophy. Clin. Sci. 81, 287-288 (1991).
- Tremblay, J. P., et al. Results of a triple blind clinical study of myoblast transplantations without immunosuppressive treatment in young boys with Duchenne muscular dystrophy. Cell Transplant. 2, 99-112 (1993).
- Gussoni, E., Blau, H. M., Kunkel, L. M. The fate of individual myoblasts after transplantation into muscles of DMD patients. Nat. Med. 3, 970-977 (1997).
- Palmieri, B., Tremblay, J. P., Daniele, L. Past, present and future of myoblast transplantation in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Pediatr. Transplant. 14, 813-819 (2010).
- Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Acute hydrodynamic forces and apoptosis: a complex question. Biotechnol. Bioeng. 98, 772-788 (2007).
- Asakura, A., Rudnicki, M. A. Side population cells from diverse adult tissues are capable of in vitro hematopoietic differentiation. Exp. Hematol. 30, 1339-1345 (2002).
- Asakura, A., et al. Increased survival of muscle stem cells lacking the MyoD gene after transplantation into regenerating skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 16552-16557 (2007).
- Gerard, X., et al. Real-time monitoring of cell transplantation in mouse dystrophic muscles by a secreted alkaline phosphatase reporter gene. Gene Ther. 16, 815-819 .
- Tajbakhsh, S., Rocancourt, D., Cossu, G., Buckingham, M. Redefining the genetic hierarchies controlling skeletal myogenesis Pax-3 and Myf-5 act upstream of MyoD. Cell. 89, 127-138 (1997).
- Beauchamp, J. R., et al. Expression of CD34 and Myf5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells. J. Cell Biol. 151, 1221-1134 (2000).
- Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Seale, P., Asakura, A., Rudnicki, M. A. Reduced differentiation potential of primary MyoD-/- myogenic cells derived from adult skeletal muscle. J. Cell Biol. 144, 631-643 (1999).
- Bischoff, R. Regeneration of single skeletal muscle fibers in vitro. Anat. Rec. 182, 215-235 (1975).
- Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J. Cell Biol. 159, 123-134 (2002).
- Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
- Farina, N. H., et al. A role for RNA post-transcriptional regulation in satellite cell activation. Skelet. Muscle. 2, 21-21 (2012).
- Tanaka, K. K., Hall, J. K., Troy, A. A., Cornelison, D. D., Majka, S. M., Olwin, B. B. Syndecan-4-expressing muscle progenitor cells in the SP engraft as satellite cells during muscle regeneration. Cell Stem Cell. 4, 217-225 (2009).
- Pallafacchina, G., et al. An adult tissue-specific stem cell in its niche: a gene profiling analysis of in vivo quiescent and activated muscle satellite cells. Stem Cell Res. 4, 77-91 (2009).
