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방법 논문

조류 종의 소화 기관을 통과 한 후 감염성 프리온을 확인하기위한 절차

10.4K 조회수

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DOI:

10.3791/50853

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2013년 11월 6일

 ,  ,  , 

이 논문에서

요약

청소부는 질병이없는 지역에 자신의 배설물에 전염성 전염성 해면상 뇌증의 프리온을 이동시키다 수있는 가능성이있다. 우리 마우스 적응 스크래피 프리온은 미국의 까마귀의 소화 기관 (까마귀 brachyrhynchos), 죽은 동물의 일반적인 소비자 비록 통과 후 감염성 유지 여부를 확인하는 데 사용 세부 방법.

초록

감염성 프리온 PRP (해상도) 재료는 가능성이 치명적인 신경 퇴행성 전염성 해면상 뇌증 (TSE) 질병 (1)의 원인이된다. 만성 소모성 질병 (CWD) 등 TSE 질병의 전송은, 동물 2,3에 동물에서뿐만 아니라 환경 소스를 4-6로 추정된다. 청소부와 육식 소비와 CWD 오염 된 썩은 고기의 배설물을 통해의 PrP 해상도 물질을 이동시키다하는 가능성이있다. 최근 작품은 미국의 까마귀의 소화 시스템 (까마귀 brachyrhynchos), 공통 북미 헤매다 ~ 7의 PrP 해상도 물질의 통과를 기록했다.

우리는 미국의 까마귀를 통해 고해상도의 PrP 물질의 통과를 문서화하는 데 사용되는 절차에 대해 설명합니다. 크로우는 RML 변형 마우스 적응 스크래피와 gavaged하고, 배설물은 4 시간 포스트 위관을 수집 하였다. 까마귀 배설물로 다음 풀링 및 복강 주사 하였다C57BL / 6 마​​우스. 그들은 마우스 스크래피의 임상 증상을 표현하고, 그 후 안락사 될 때까지 마우스는 매일 관찰 하였다. 증상이 마우스는 365 일 후 접종 할 때까지 감시했다. 웨스턴 블롯 분석은 질병 상태를 확인하기 위하여 실시 하였다. 결과 프리온 테스트 마우스에있는 질병을 일으키는 원인이 까마귀의 소화 시스템을 통해 여행 후 감염을 유지하고 배설물에 존재하는 것으로 나타났다.

서론

전염성 해면상 뇌증 (TSE)는 야생 동물에 영향을 미치는 치명적인 전염성 신경 퇴행성 질환, 가축, 인간입니다. TSE 질병의 전염 물질은 프리온 단백질 1의 잘못 폴딩 또는 병원성 이소 PRP (해상도)이 나타납니다. 양과 염소의 스크래피,, 소 해면상 뇌증 (동물 TSE 질환 노새 사슴 (Odocoileus의 hemionus), 흰 꼬리 사슴 (Odocoileus의 virginianus), 엘크 (Cervus의의 elaphus), 그리고 사슴 (에 Alces alces)에 만성 소모성 질병 (CWD)를 포함 국내 가축의 BSE) 으 농장 밍크의 전염성 밍크 뇌증, 고양이의 고양이 해면상 뇌증, 인간이 아닌 영장류 8과 해면상 뇌증, 이국적인 동물원에 이국적인 유제 해면상 뇌증은 가족 Bovidae의 반추. 하나의 인간 TSE 질환, 변종 크로이츠 펠트 - 야콥 병은 희귀의 PrP RES-contamin 소비에 의해 인수 될 것으로 생각됩니다ated 음식 9. 오염 된 쇠고기가 10을 소비하는 경우 마찬가지로, BSE가 인간을 감염시킬 수 있습니다. 모든 TSE 질환, 스크래피와 CWD는 동물에서 동물

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프로토콜

우리 프로토콜은 우리가 이전에 7을 발표 한에서 적용됩니다. 동물과 관련된 모든 절차는 미국 농무부 (USDA) 동식물 건강 검사 서비스 (APHIS), 야생 동물 서비스 (WS), 국립 야생 동물 연구 센터 (NWRC)의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 까마귀 Gavaging

  1. 미국의 까마귀의 소화관을 통해 '의사 뇌 물질'의 통과 시간을 예상하고있다.
    1. 요리 (그림 1) 투여 바늘 2를 사용하여 청색 염료 및 위관 1 까마귀와 계란을 스크램블 5 ㎖를 혼합한다.
    2. 블루 / 그린 묻은 대변 배설을 더 이상 제공하지 않습니다 때까지 까마귀에게 30 분마다 확인합니다.
  2. 감염되지 않은 및 말기 RML (챈들러 주)에 감염된 C57BL / 6 마​​우스의 뇌를 얻습니다.
  3. 1X와 총알 블렌더 균질의 정상 20 % 중량 / 부피 감염된 마우스의 뇌 균질 생성인산염 완충 생리 식염수 (PBS)과 유리 구슬, 다음 큰 입자상 물질을 제거하기 위해 1 분 3,000 XG에 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 멸균 PBS의 10 % 중량 / 부피를 생성하는 1X PB....

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결과

사용 절차는 까마귀의 소화 시스템이 스크래피 뇌 균질 7의 경구 위관 이후의 PrP 해상도 감염 4 시간을 제거하지 않음을 보여줍니다. 의 PrP 해상도 재료로 gavaged 된 모든 스물 까마귀 이후 마우스에 대변을 통해의 PrP 해상도의 자료를 전송. 병에 걸린 마우스는 임상 마우스 스크래피 증상과 질병의 확인이 웨스턴 블롯 분석에 의해 완성되었다의 발현에 의해 확인되었다.

까마귀에 의해 섭취 된 물질의 유지 시간의 조사는 대변에있는 염료의 존재 (그림 1)에 따라 4 시간, 될 수있는 gavaged 까마귀의 소화관 통과 시간을 공개했다. 모든 배설물은 일회용 피펫으로 수집하고 각 까마귀 (그림 2)을 위해 풀링했다. 치료 까마귀 배설물에서 급성 독성 원시 배설물 상등액 파일럿 테스트 마우스에 IP를 주입 할 때 발생했습니다. 페니실린.......

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토론

우리는 까마귀의 소화 시스템을 통해의 PrP 해상도 물질의 통과를 문서화하는 과정을 보여줍니다. 우리는 까마귀는 질병이없는 지리적 영역의 PrP 해상도 물질을 이동시키다 수있는 능력을 가지고 있는지 확인하기 위해 기존의 방법을 사용했다. 다른 사람은 그것을 제거하는 데 실패 둘 다 19 ~ 21과 설치류 (22, 23) 소화 체액을 반추하는의 PrP 해상도의 저항을 평가했다. 그들은 또한 잠재적으로 썩은 트리암시놀론 주입술 해상도 물질 발생 및 프리온 질병의 확산을 촉진 풍경을 통해이 물질을 수송 할 수 이러한 기술의 미래 응용 프로그램은 다른 육식 동물 (24)에 적용되어야한다.

우리는 까마귀의 소화관을 통해 균질 마우스 뇌의 대략적인 통과 시간을 평가하는 간단한 방법을 제공하고, 우리의 스크램블 '의사 두뇌 물질에 파란색 식용 색.......

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공개 사항

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

우리는이 연구와 USDA에 사용 된 까마귀를 제공하기위한 S. 베르너에게 감사의 말씀을 전합니다, APHIS, 동물 관리 및 모니터링을위한 WS, NWRC 동물 관리 직원. 기재 또는 제품의 사용은 USDA의 보증을 의미하지는 않습니다. 이 연구를위한 자금 조달은 USDA, APHIS, 수의 서비스에 의해 제공되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
RML 챈들러 균주 마우스 적응 스크래피Rocky Mountain Laboratories
RC57BL/6 마우스Hilltop Lab Animals
미국 까마귀야생 포획
펜/스트렙Invitrogen15140-122
인산염 완충 식염수Invitrogen70011-044
SonicatorMisonix
Proteinase-K 용액Roche3115887001
로딩 버퍼InvitrogenNP0007 및 0009
Bis-tris SDS PAGE 12% 겔InvitrogenNP0342
Immobilon PVDF 멤브레인Millipore1SEQ00010
Tween 20Sigma AldrichP2287
Bullet 블렌더 균질화기Braintree ScientificBBX24B
2.3mm 지르코니아/실리카 비드BioSpec Products11079125Z
Bar224 anti-PrP monoclonal 항체Cayman Chemical10009035
SuperblockThermo Scientific37517
화학발광 기질Millipore WBKLS0500
G-box 젤 문서화 시스템Syngene

참고문헌

  1. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  2. Miller, M. W., Williams, E. S., et al. Epizootiology of chronic wasting disease in free-ranging cervids in Colorado and Wyoming. Journal o....

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