Rutiner for å identifisere Smittsomme Prions Etter passasje gjennom fordøyelsessystemet til en fuglearter

Summary

Åtseletere har potensial til å translocate smittsomme overførbare spongiforme encefalopati prioner i deres avføring til sykdomsfrie områder. Vi detalj metoder som brukes for å avgjøre om mus-tilpasset skrapesyke prioner forbli smittsomme etter passering om fordøyelseskanalen av amerikanske kråker (Corvus brachyrhynchos), en vanlig forbruker av døde dyr.

Abstract

Infeksiøs prion (PrP ^Res) materialet er sannsynligvis årsaken til dødelig, nevrodegenerativ overførbar spongiform encefalopati (TSE) sykdommer ^en. Overføring av TSE-sykdommer, slik som kronisk wasting sykdom (CWD), er antatt å være fra dyr til dyr ^2,3, så vel som fra miljøkilder ^4-6. Åtseletere og rovdyr har potensial til å translocate PrP ^Res materiale gjennom forbruk og utskillelse av CWD-forurenset åtsler. Nyere arbeider har dokumentert passering av PrP ^Res materiale gjennom fordøyelsessystemet av amerikanske kråker (Corvus brachyrhynchos), en felles nordamerikanske gatefeier ^7.

Vi beskriver prosedyrer som brukes til å dokumentere passering av PrP ^Res materiale gjennom amerikanske kråker. Crows ble gavaged med RML-belastning mus-tilpasset skrapesyke og deres avføring ble samlet 4 hr innlegg sonde. Kråke avføring ble deretter samlet og injisert intraperitonealt innC57BL / 6 mus. Musene ble overvåket daglig inntil de uttrykte kliniske tegn på muse skrapesyke og ble deretter avlives. Asymptomatiske mus ble fulgt til 365 dager etter vaksinasjonen. Western blot-analyse ble utført for å bekrefte sykdomsstatus. Resultatene viste at prioner forbli smittefarlig etter reiser gjennom fordøyelsessystemet til kråker og er til stede i avføringen, forårsaker sykdom hos test mus.

Introduction

Overførbare spongiforme encefalopatier (TSE) er dødelige smittsomme nevrodegenerative lidelser som påvirker dyreliv, husdyr og mennesker. Smittestoffet av TSE sykdommer ser ut til å være misfolded eller patogene isoformer (PrP ^Res) av prionproteiner ^en. Animal TSE sykdommer inkluderer chronic wasting disease (CWD) i hjort (Odocoileus hemionus), white-tailed deer (Odocoileus virginianus), elg (Cervus elaphus), og elg (Alces alces), skrapesyke hos sau og geit, bovin spongiform encefalopati ( BSE) i husdyr; overfør mink encefalopati hos oppdretts mink; feline spongiform encefalopati hos katter; eksotisk hovdyr spongiform encefalopati i eksotiske dyrehagen ruminates av familien Bovidae, og spongiform encefalopati hos ikke-menneskelige primater ^åtte. Den eneste menneske TSE sykdom, variant Creutzfeldt-Jakobs sykdom, er sjeldne og tenkte å bli kjøpt opp av forbruker PrP ^Res-contaminrerte mat ^ni. På samme måte kan BSE smitte mennesker hvis forurenset biff er fortært ^10. Av alle TSE sykdommer, skrapesyke og CWD er de to eneste med selvbærende epidemier og kilder for smitte antas å være fra dyr til dyr ^2,3,11 samt fra miljø kilder ^4-6. Forskning tyder på at de fleste TSE sykdommer krever bemerkelsesverdige lengre inkubasjonsperioder fra naturlige eksponerings hendelser av PrP ^Res materialet til manifestasjon av kliniske tegn ^2-4,6,8 og åpenbare arter barrierer minimere, men ikke eliminere muligheten for, uspesifikt overføring ^12-14 .

Identifisere mekanismer for spredning av smittsomme prion (PrP ^Res) materialet er ekstremt viktig for å svare på spørsmål om hvordan TSE sykdommer beveger seg over landskapet. Eksperimentelle undersøkelser har antydet at insekter ^15,16, fjørfe og svin ^17, og amerikanske kråker (Corvus Brachyrhynchos) ^7,18 er passive bærere eller dispersers av PrP ^Res materiale. Passering av PrP ^Res materiale gjennom fordøyelsessystemet til kråker har nylig blitt dokumentert, viser hvilken rolle de kan spille i spredning av TSE sykdommer ^7. Disse resultatene gjør det plausibelt at kråker, en gatefeier, kan støte på, forbruke, og transportere infeksiøst materiale via avføring deponering, til sykdomsfrie områder.

Prosedyrene vi viser her ble brukt til å dokumentere passering av PrP ^Res materiale gjennom fordøyelsessystemet hos kråker, og vil i stor grad lette anvendelsen av disse metodene til andre åtseldyr og rovdyr-spesifikke modeller i relatert fremtidig forskning. I denne studien konvensjonelle metoder ble brukt for å undersøke en ukonvensjonelle midler for menneskehandel PrP ^Res materiale, som kan bidra til spredning og totale byrden av PrP ^Res materiale.

Protocol

Vår protokollen er tilpasset fra en vi tidligere utgitt syv. Alle prosedyrer som involverer dyr ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee of the United States Department of Agriculture (USDA), dyre-og plantehelse Inspection Service (APHIS), Wildlife Services (WS), National Wildlife Research Center (NWRC). En. Crow Gavaging Anslå passasjen tid av pseudohjernemateriale "gjennom fordøyelseskanalen av amerikanske kråker. Bland 5 ml tilber…

Representative Results

Fremgangsmåtene som benyttes demonstrere at fordøyelsessystemet kråke ikke eliminere PrP Res infectivity 4 timer etter oral gavage med skrapesyke hjerne homogenat 7.. Alle tjue kråker som ble gavaged med PrP Res materialet senere overført PrP Res materialet via avføring til mus. Syke mus ble identifisert av manifestasjon av kliniske mus-skrapesyke tegn og sykdom bekreftelse ble fullført av Western blot analyse. Undersøkelse av retensjonstid…

Discussion

Vi viser en prosedyre for å dokumentere passering av PrP ^Res materiale gjennom fordøyelsessystemet til kråkene. Vi har benyttet konvensjonelle fremgangsmåter for å bestemme om galer har evnen til å translocate PrP ^Res materialet til sykdomsfrie geografiske områder. Andre har evaluert motstand av PrP ^Res til drøvtyggere ^19-21 og gnager ^22,23 fordøyelsesvæsker, som begge klarte å eliminere den. Fremtidig bruk av disse teknikkene skal brukes til andre rovdyr…

Materials

RML Chandler strain mouse-adapted scrapie	Rocky Mountain Laboratories
RC57BL/6 mice	Hilltop Lab Animals
American crows	wild captured
Pen/Strep	Invitrogen	15140-122
Phosphate buffered Saline	Invitrogen	70011-044
Sonicator	Misonix
Proteinase-K solution	Roche	3115887001
Loading buffer	Invitrogen	NP0007 and 0009
Bis-tris SDS PAGE 12% gel	Invitrogen	NP0342
Immobilon PVDF membrane	Millipore	1SEQ00010
Tween 20	Sigma Aldrich	P2287
Bullet blender homogenizer	Braintree Scientific	BBX24B
2.3 mm Zirconia/silica beads	BioSpec Products	11079125Z
Bar224 anti-PrP monoclonal antibody	Cayman Chemical	10009035
Superblock	Thermo Scientific	37517
chemiluminescent substrate	Millipore	WBKLS0500
G-box gel documentation system	Syngene