에 대한 마이크로 미터 프로브의 원격 자기 발동 현장에서 3D 매핑

Summary

이 논문은 세균 바이오 필름과 현장에서 인터페이스에서 미생물에 의해 만들어진 복잡한 생활 소재의 로컬 기계적 특성을 측정 할 수있는 전용 자기 핀셋의 개발에 씨앗을 품고 자기 입자의 원격 작동에 따라 원래의 방법을 보여줍니다.

Abstract

인터페이스에 대한 세균의 부착과 성장을 입체적 이종 구조 소위 바이오 필름의 형성으로 이어질. 이러한 구조에 사는 세포는 세포 외 고분자 물질의 네트워크에 의해 매개 물리적 상호 작용에 의해 함께 개최됩니다. 세균 바이오 필름은 많은 인간의 활동에 영향을 미칠 및 해당 속성에 대한 이해는 개발의 더 나은 제어를 위해 매우 중요합니다 - 유지 보수 또는 근절 - 자신의 불리한 유익한 결과에 따라. 이 논문은 지금까지 단 거시적 균질 재료의 관점에서 검토, 현장에 있었다 바이오 필름의 지역의 물리적 특성을 측정하기 위해 목표로하는 새로운 방법을 설명합니다. 여기에 설명 된 실험은 원격으로 바이오 필름의 구조적 특성을 방해하지 않고 작동 할 수있는 지역의 프로브를 씨앗에 성장하는 바이오 필름에 자성 입자를 도입하는 것을 포함한다. 전용 자기 핀셋 deve을했다바이오 필름에 포함 된 각 입자에 정의 된 힘을 발휘하는 loped. 설치는 입자를 잡아 당기는 기간의 시간 경과 영상의 기록이 가능하도록 현미경의 무대에 장착된다. 입자 궤적이어서 당기는 시퀀스로부터 추출되고, 로컬 점탄성 파라미터함으로써 파라미터의 3 차원 공간 분포를 제공하고, 각 입자 변위 곡선으로부터 유도된다. 생물막 기계적 프로필 통찰력을 얻는 것은 구조적 특성 및 이들 구조의 특정 생물 사이의 관계를 명확히하기 위해 생물막 제어 목적 뷰 엔지니어의 관점에서뿐만 아니라, 기본적인 관점에서 필수적이다.

Introduction

세균 바이오 필름은 생물학적 또는 인공 표면 ^1-3와 관련된 박테리아의 사회입니다. 이들은 ^{4,5 구성물을} 보호하고 안정화 다당류 풍부한 세포 외 매트릭스의 제조와 결합 접착 성장 메커니즘에 의해 형성한다. 이 바이오 필름은 표면에 붙어있는 세포를 단순히 수동적 군집 아니지만, 조직 및 동적 복잡한 생물학적 시스템. 박테리아가 바이오 필름의 라이프 스타일에 플랑크톤에서 전환하면, 유전자 발현 및 세포 생리학의 변화는 항생제에 저항을 증가뿐만 아니라 관찰 많은 지속 및 만성 감염 ^(6)의 원점 인 면역 방어를 호스팅하고 있습니다. 그러나 이러한 생활 구조의 제어 개발은​​ 또한 유해 폐기물 사이트의 생물학적, 공업용 또는 contamin에서 토양과 지하수를 보호하기 위해 바이오 장벽의 형성 바이오 여과 등의 산업 및 환경 응용을위한 기회를 제공ATION.

삶의 바이오 필름의 방법으로 특정 분자 기능이 점점 더 설명하는 동안, 지역 사회 개발 및 지속성을 구동 메커니즘은 불분명하다. 스캔 전기 또는 형광 현미경을 사용하여 마이크로 측정에 대한 최근의 발전을 사용하여이 살고있는 조직 구조, 화학 및 생물 학적 이질성 ⁷ 상당한 전시하는 것으로 나타났다. 그러나, 지금....

Protocol

1. 박테리아 문화와 서스펜션 준비

1. , Lysogeny 국물 (LB) 한천 플레이트에서 갓 식민지를 선택 LB 액체 배지를 100 μ g / ml의 암피실린 및 7.5 μ g / ml의 테트라 사이클린을 포함하는 5 ㎖에 접종하고에 37 ° C에서 5 ~ 6 시간 동안 그것을 품어 플랫폼을 흔들어.
2. 그런 다음, 최소 배지 (M63B1)는 0.4 %의 포도당과 같은 항생제의 농도와 보충 5 ㎖의 세균 배양의 100 μ 리터를 추가합니다. 흔들리는 플랫폼에서 37 ° C에서이 갓 희석 문화 밤새 품어.
3. 배양 16 시간 후, 5 ㎖ M63B1, 0.4 % 포도당에 하룻밤 문화 μL (100)를 추가합니다. 0.5 OD까지 흔들리는 플랫폼으로 37 ° C에서 튜브를 유지에 도달합니다. 서스펜션은 biofilm 형성에 대한 실험 채널에 주입 한 다음 준비가되어 있습니다.

2. 자기 입자 제조

1. 10 ㎕의 자성 입자를 타고 -2.8 μ m 직경 - 재고하고 세척은 자기 샘플 랙의 도움으로 190 ㎕의 최소 배지에서 3 배.
2. 5 × ⁶ 구슬 / ㎖로 입자 농도를 조정합....

Results

전형적인 분석은 원래의 배치를 방해하지 않고 생활 생물막에 미크론 스케일에서 점탄성 파라미터의 공간 분포를 제공 할 것이다. 탄성 컴플라이언스 - - 깊이와 함께 바이오 필름의 횡 방향 치수를 따라 Y 축, Z 축의 함수로서 주어진다 전형적인 결과는 J _0의 값을도 7에 나타낸다. 각 점은 크리프 곡선 분석은 J ₀ 값을 제공 한 구슬에 해당합니다. 데이터는 거의 3 크기 순서뿐만 아니라 그 강력한 측면 이질성을 통해 바이오 필름의 깊이에 따라 변화 지역을 준수 모든 바이오 필름의 높이에서 열렸다 것으로 나타났다.

데이터는 또한 바이오 필름의 기계적 특성이 지원되었는지 강한 표시를 제공하고, 여기에서 확산 및 비대칭 형상 (도 8)를 나타내 컴플라이언스 값의 분포에 액세스를 준높은 고분자 겔을 가교. 사실, 유사한 동작은 이전에 집중 높은 가교 말라 젤 ^23에

Discussion

이 자성 입자는 파종 및 원래 상태에있는 성장하고있는 바이오 필름의 점탄성 매개 변수의 현장의 3D 매핑에 사용 실험을 당겨. 이 방법은 E.의 기계적 이질 밝혀 대장균 바이오 필름은 여기에서 성장 강하게 기본적인 세포 외 기질 (extracellular matrix)의 의미와 가교의 더 정확하게 그 정도를 제안, 바이오 필름 ​​물성을 지원하는 생물막 구성 요소를 지적하는 단서를 주었다.

세균 바이오 필름의 기계적 특성 패턴의 인식은 이러한 복잡한 물질의 포괄적 인 표현을 구축하기위한 매우 중요합니다. 이러한 연구 결과는 기계적인 패턴과 같은 바이오 필름 개발을 뒷받침하는 원동력을 명확히하는 데 도움이 유전자 발현 microniches, 생물 학적 이질성을 연결하는 인과 관계를 명확하게하는 방법을 엽니 다.

지금까지 바이오 필름 메카의 문제nical 속성보기의.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1: 시약 및
세포 자성 입자	Life technologies	14307D	Micrometric magnetic particle, 2.8 µ m 직경
암피실린 (항생제)	Sigma-Aldrich	A9518
테트라사이클린 (항생제)	Sigma-Aldrich	87128
박테리아 균주 MG1655gfpF	UGB, Institut Pasteur, France		암피실린 및 테트라사이클린에 내성이 있는 표면에서 F pili를 생성합니다.
Table 2 : < / strong> 소
아 관류 용	Prodimed-Plastimed	6932002
중공 광장 모세 혈	금속 과학	8280-100	붕규산 유리로 제조. 정사각형 0.8 mm x 0.8 mm
튜빙 실리콘 퍼옥사이드	VWR international	228-0512	직경 1 mm
튜빙 실리콘 퍼옥사이드	VWR international	228-0700	직경 3 mm
Table 3: Biofilm growth
lysogeny Broth (LB) solution	Amresco-VWR	J106-10PK	박테리아를 성장시키는 데 사용되는 표준 매체.
M63B1 솔루션	박테리아	를 성장시키는 데 사용되는
포도당	Sigma-Aldrich	G8270	포도당 0.4%로 M63B1 매체를 만드는 데 사용됩니다.
표 4: 전자
카메라 EMCCD	하마마츠	C9100-02
히터 컨트롤러	세계 정밀 기기	300354
함수 발생기	애질런트 기술	33210A
전력 증폭기	집에서 만든		최대 4A의 진폭을 가진 전류 신호를 제공합니다.
주사기 펌프	Kd Scientific	KDS-220
셔터	Vincent Associates	Uniblitz T132
자기 핀셋	집에서 만든		두 개의 전자기 극, 각각 직경 0.56mm 구리선의 2,120회 회전이 있는 구리 코일과 연자성 합금 코어(Supra50-Arcelor Mittal, 프랑스)는 <강>그림 10에 표시된 청사진에 따라 정사각형 모양입니다. 두 개의 코어는 모세관의 길이를 따라 한 방향으로 자기력을 생성하기 위해 남극을 향하도록 북극을 향하도록 장착됩니다. 그림 11에서 코일 배선에 대한 세부 정보를 참조하십시오.
표 5: 광학
도립 현미경	Nikon	TE-300
S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)	Nikon		이것은 생물막을 심층적으로 관찰할 수 있는 긴 작동 거리 대물렌즈입니다.
에피 형광 필터 : 1) 녹색 형광 : Exc 480 / 20 nm; DM 495; 엠 510/20  2) 적색 형광의 경우: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	힘 적용 시 입자 변위는 적색 형광 필터 블록을 사용하여 기록됩니다.
Table 6: 이미지 분석
ImageJ	NIH - 입자 추적기 플러그인