에 대한 마이크로 미터 프로브의 원격 자기 발동<em> 현장에서</em세균 바이오 필름 물성> 3D 매핑

Summary

이 논문은 세균 바이오 필름과 현장에서 인터페이스에서 미생물에 의해 만들어진 복잡한 생활 소재의 로컬 기계적 특성을 측정 할 수있는 전용 자기 핀셋의 개발에 씨앗을 품고 자기 입자의 원격 작동에 따라 원래의 방법을 보여줍니다.

Abstract

인터페이스에 대한 세균의 부착과 성장을 입체적 이종 구조 소위 바이오 필름의 형성으로 이어질. 이러한 구조에 사는 세포는 세포 외 고분자 물질의 네트워크에 의해 매개 물리적 상호 작용에 의해 함께 개최됩니다. 세균 바이오 필름은 많은 인간의 활동에 영향을 미칠 및 해당 속성에 대한 이해는 개발의 더 나은 제어를 위해 매우 중요합니다 – 유지 보수 또는 근절 – 자신의 불리한 유익한 결과에 따라. 이 논문은 지금까지 단 거시적 균질 재료의 관점에서 검토, 현장에 있었다 바이오 필름의 지역의 물리적 특성을 측정하기 위해 목표로하는 새로운 방법을 설명합니다. 여기에 설명 된 실험은 원격으로 바이오 필름의 구조적 특성을 방해하지 않고 작동 할 수있는 지역의 프로브를 씨앗에 성장하는 바이오 필름에 자성 입자를 도입하는 것을 포함한다. 전용 자기 핀셋 deve을했다바이오 필름에 포함 된 각 입자에 정의 된 힘을 발휘하는 loped. 설치는 입자를 잡아 당기는 기간의 시간 경과 영상의 기록이 가능하도록 현미경의 무대에 장착된다. 입자 궤적이어서 당기는 시퀀스로부터 추출되고, 로컬 점탄성 파라미터함으로써 파라미터의 3 차원 공간 분포를 제공하고, 각 입자 변위 곡선으로부터 유도된다. 생물막 기계적 프로필 통찰력을 얻는 것은 구조적 특성 및 이들 구조의 특정 생물 사이의 관계를 명확히하기 위해 생물막 제어 목적 뷰 엔지니어의 관점에서뿐만 아니라, 기본적인 관점에서 필수적이다.

Introduction

세균 바이오 필름은 생물학적 또는 인공 표면 ^1-3와 관련된 박테리아의 사회입니다. 이들은 ^{4,5 구성물을} 보호하고 안정화 다당류 풍부한 세포 외 매트릭스의 제조와 결합 접착 성장 메커니즘에 의해 형성한다. 이 바이오 필름은 표면에 붙어있는 세포를 단순히 수동적 군집 아니지만, 조직 및 동적 복잡한 생물학적 시스템. 박테리아가 바이오 필름의 라이프 스타일에 플랑크톤에서 전환하면, 유전자 발현 및 세포 생리학의 변화는 항생제에 저항을 증가뿐만 아니라 관찰 많은 지속 및 만성 감염 ^(6)의 원점 인 면역 방어를 호스팅하고 있습니다. 그러나 이러한 생활 구조의 제어 개발은​​ 또한 유해 폐기물 사이트의 생물학적, 공업용 또는 contamin에서 토양과 지하수를 보호하기 위해 바이오 장벽의 형성 바이오 여과 등의 산업 및 환경 응용을위한 기회를 제공ATION.

삶의 바이오 필름의 방법으로 특정 분자 기능이 점점 더 설명하는 동안, 지역 사회 개발 및 지속성을 구동 메커니즘은 불분명하다. 스캔 전기 또는 형광 현미경을 사용하여 마이크로 측정에 대한 최근의 발전을 사용하여이 살고있는 조직 구조, 화학 및 생물 학적 이질성 ⁷ 상당한 전시하는 것으로 나타났다. 그러나, 지금까지 바이오 필름의 역학은 주로 거시적으로 조사되었다. 예를 들어, 바이오 필름 ​​깃발의 관찰에 의한 유체 유량 ^8,9의 변화에 변형 바이오 필름 ​​조각의 일축 압축 한천 배지에서 올리거나 커버 한 후 ^{10, 11,} 환경에서 수집 된 바이오 필름의 전단과 병렬로 전송 슬라이드에 성장 플레이트 레오 미터 ^12,13, AFM 캔틸레버 ⁽¹⁴⁾ 나 전용 MICR 부착 세균 바이오 필름과 유리 구슬과 코팅을 이용하여 원자 힘 분광분리 된 바이오 필름 ​​조각 ^{(15, 16)의} 인장 강도를 측정하기위한 ocantilever 방법은 재료 ^(17)의 점탄성 특성에 대한 유용한 정보를 제공, 지난 10 년 동안 구현되었습니다. 그러나,이 재료는 흔히 이러한 방법에서의 경우와 네이티브 환경으로부터 제거 될 때 동일계 생물막 기계적 특성에 대한 정보가 손실 된 것으로 보인다. 또한, 균일 한 물질로서 바이오 필름의 처리는 커뮤니티 내 물성 가능한 이질성에 대한 정보를 벗어났습니다. 따라서, 구조 biofilm 형성의 역학과 같은 유전자 발현 패턴 또는 화학 그라데이션 같은 생물학적 특성의 정확한 의미는 거의 인식 할 수 없습니다. 바이오 필름 물성의 마이크로 설명으로 진행하기 위해, 새로운 전용 도구가 필요합니다.

이 논문은 달성하기 위해 생각 원래의 접근 방법의 자세한 사항생물막을 방해하고 마이크로 물질 특성의 공간적 분포의 그린 다음 기계 이질성을 사용하지 않고 현장에서 지역 기계 매개 변수의 측정. 실험의 원리는 성숙 생물막 자성 핀셋을 사용하여 원격 로딩 하였다 자성 미세 입자와 함께 성장하는 생물막의 도핑 달려. 현미경으로 몇 군데 제어 자력 응용 프로그램에서 입자 변위는 지역 점탄성 매개 변수 유도, 자신의 지역 환경을보고 각각의 입자 수 있습니다. 이 데이터에서 바이오 필름의 3D 기계 프로파일은 공간 및 환경 조건 의존성을 드러내는, 그릴 수 있습니다. 전체 실험 E. 여기에 표시됩니다 derepressed F와 같은 플라스미드를 운반하는 유전자 조작 변형에 의해 대장균 바이오 필름. 최근의 논문 ^(18)에 상술 결과는 그대로 생물막 기계의 내부의 독특한 비전을 제공.

Protocol

1. 박테리아 문화와 서스펜션 준비 , Lysogeny 국물 (LB) 한천 플레이트에서 갓 식민지를 선택 LB 액체 배지를 100 μ g / ml의 암피실린 및 7.5 μ g / ml의 테트라 사이클린을 포함하는 5 ㎖에 접종하고에 37 ° C에서 5 ~ 6 시간 동안 그것을 품어 플랫폼을 흔들어. 그런 다음, 최소 배지 (M63B1)는 0.4 %의 포도당과 같은 항생제의 농도와 보충 5 ㎖의 세균 배양의 100 μ 리터를 추가…

Representative Results

전형적인 분석은 원래의 배치를 방해하지 않고 생활 생물막에 미크론 스케일에서 점탄성 파라미터의 공간 분포를 제공 할 것이다. 탄성 컴플라이언스 – – 깊이와 함께 바이오 필름의 횡 방향 치수를 따라 Y 축, Z 축의 함수로서 주어진다 전형적인 결과는 J 0의 값을도 7에 나타낸다. 각 점은 크리프 곡선 분석은 J 0 값을 제공 한 구슬에 해당합니다. 데이터는 거의 3 크기 …

Discussion

이 자성 입자는 파종 및 원래 상태에있는 성장하고있는 바이오 필름의 점탄성 매개 변수의 현장의 3D 매핑에 사용 실험을 당겨. 이 방법은 E.의 기계적 이질 밝혀 대장균 바이오 필름은 여기에서 성장 강하게 기본적인 세포 외 기질 (extracellular matrix)의 의미와 가교의 더 정확하게 그 정도를 제안, 바이오 필름 ​​물성을 지원하는 생물막 구성 요소를 지적하는 단서를 주?…

Materials

Table 1: Reagents and cells
Magnetic particles	Life technologies	14307D	Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter
Ampicillin (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	A9518
Tetracycline (Antibiotic)	Sigma-Aldrich	87128
Bacterial strain MG1655gfpF	UGB, Institut Pasteur, France		produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline
Table 2:  Capillaries and tubing
Filters for pediatric perfusion	Prodimed-Plastimed	6932002
Hollow Square Capillaries	Composite Metal Scientific	8280-100	Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8mm x0.8mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0512	Diameter 1mm
Tubing silicone peroxyde	VWR international	228-0700	Diameter 3mm
Table 3: Biofilm growth
Lysogeny Broth (LB) solution	Amresco-VWR	J106-10PK	standard medium used to grow bacteria
M63B1 solution	Home-made		Standard minimum  medium used to grow bacteria
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose
Table 4: Electronics
Camera EMCCD	Hamamatsu	C9100-02
Heater controller	World precision instruments	300354
Function generator	Agilent technologies	33210A
Power amplifier	Home-made		It gives a current signal with amplitudes up to 4 A.
Syringe pumps	Kd Scientific	KDS-220
Shutter	Vincent Associates	Uniblitz T132
Magnetic tweezers	Home-made		Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Fig. 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11.
Table 5: Optics
Inverted microscope	Nikon	TE-300
S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)	Nikon		This a long working distance ojective enabling observation of the biofilm in the depth
Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20  2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block.
Table 6: Image analysis
ImageJ	NIH – particle tracker plugin