Potentiel de membrane Dye Imaging de ventromédian hypothalamus neurones de souris adulte à étudier Glucose Sensing
Summary
L'activité des neurones isolés à partir de souris adultes, âgées peut être étudiée en dissociant les neurones à partir de régions spécifiques du cerveau et en utilisant l'imagerie de colorant potentiel de membrane fluorescent. Par les réponses de test à des changements dans le glucose, cette technique peut être utilisée pour étudier la sensibilité au glucose des neurones hypothalamiques ventromédians adultes.
Abstract
Les études de l'activité neuronale sont souvent effectuées à l'aide de neurones rongeurs moins de 2 mois d'âge en raison des difficultés techniques liées à l'augmentation du tissu conjonctif et une diminution de la viabilité neuronale qui se produisent avec l'âge. Ici, nous décrivons une méthodologie pour la dissociation des neurones hypothalamiques sains provenant de souris adultes âgés. La possibilité d'étudier les neurones de souris adultes d'âge permet l'utilisation de modèles de maladies qui se manifestent à un âge plus avancé et peut-être plus de développement précis pour certaines études. L'imagerie par fluorescence des neurones dissociés peut être utilisé pour étudier l'activité d'une population de neurones, par opposition à l'aide d'électrophysiologie pour étudier un seul neurone. Ceci est particulièrement utile lors de l'étude d'une population neuronale hétérogène dans lequel le type désiré neuronale est rare tel que de neurones hypothalamiques de détection de glucose. Nous avons utilisé le potentiel de membrane imagerie de colorant de neurones hypothalamiques ventromédian adultes d'étudier leurs réponses à changes de glucose extracellulaire. Neurones glucose de détection sont soupçonnés de jouer un rôle dans la régulation centrale de l'équilibre énergétique. La possibilité d'étudier la détection du glucose chez les rongeurs adultes est particulièrement utile, car la prédominance des maladies liées à l'équilibre de l'énergie dysfonctionnel (par exemple. L'obésité) augmente avec l'âge.
Introduction
Le cerveau régule l'homéostasie énergétique par la neuro-endocrinien et nerveux autonome. L'hypothalamus ventromédian (VMH), composé du noyau ventromédian (VMN) et le noyau arqué (ARC), est important pour la régulation centrale de l'homéostasie énergétique. Neurones spécialisés de détection du glucose, dans le VMH, lien l'activité neuronale et l'homéostasie du glucose périphérique 1. Il existe deux types de glucose détection neurones; glucose excités (GE) neurones augmentent tandis que le glucose inhibe (GI) neurones diminuent leur activité glucose augmente extracellulaires. Neurones VMH glucose de détection sont généralement étudiés en utilisant l'électrophysiologie ou potentiel imagerie de colorant sensible au calcium / membrane.
La technique de patch-clamp électrophysiologie est considéré comme l'étalon-or dans l'étude ex vivo de l'activité neuronale. Dans cette technique, une électrode de micropipette en verre est attachée à la membrane cellulaire par l'intermédiaire d'une résistance élevée(GQ) joint. Électrodes de patch-clamp permettent enregistrement en temps réel de l'action potentielle fréquence (pince de courant) ou la conductance ionique (tension de serrage) change dans un seul neurone. Bien que la technique de patch-clamp fournit des informations détaillées en ce qui concerne les changements dans les conductances spécifiques des canaux ioniques, un inconvénient majeur est que seul un neurone peut observer à la fois. Il faut environ 30-45 minutes de l'enregistrement pour vérifier que l'on enregistre depuis un neurone de détection de glucose avant même de commencer un traitement expérimental spécifique. De plus, les neurones GI et GE comprennent <20% de la population totale de VMH neuronale. S'ajoute à ce problème est l'absence, dans de nombreux cas, d'un marqueur cellulaire pour identifier ces neurones. Ainsi, il est clair que malgré fournir des informations précieuses électrique que d'autres techniques peuvent pas, l'analyse de patch-clamp est laborieux, prend du temps et un faible rendement.
L'utilisation de l'imagerie par fluorescence des neurones dissociés VMH permet l'étude de l'hundreds de neurones simultanément. Colorants sensibles au calcium peuvent être utilisés pour mesurer les changements de calcium intracellulaire, qui sont en corrélation indirectement aux variations de l'activité neuronale. Colorants sensibles potentiels membranaires sont utilisés pour surveiller les changements potentiels de membrane. La mesure du potentiel de membrane cellulaire est un index plus directe de l'activité neuronale par rapport à des changements dans les niveaux de calcium intracellulaire. En outre, le potentiel colorant (MPD) Imagerie de membrane détecte potentiellement petites modifications du potentiel de membrane où l'action tir potentiel n'est pas altérée et les niveaux de calcium intracellulaire peut pas changer. Ces deux techniques d'imagerie de fluorescence ont été utilisées pour étudier VMH neurones glucose de détection de jeunes souris 2-7. Bien que les résultats sont moins détaillées que celles obtenues avec patch clamp électrophysiologie, la force d'expériences d'imagerie est qu'ils évaluent simultanément une grande population de cellules qui comprennent inévitablement un nombre important de neurones de détection du glucose. MPD imagerie is particulièrement utile pour étudier les neurones digestifs qui sont plus uniformément localisée dans l'ensemble du VMH, fournissant ainsi une population suffisante pour étudier dans le VMH dissocié (~ 15% IG). En revanche, si les neurones GE sont densément localisées au ventro-VMN et cellule région pauvre entre le CRA et VMN, ils ne représentent pas un nombre important de neurones dans le VMH (<1% GE). De plus, en étudiant les neurones isolés, les astrocytes et les effets présynaptiques sont éliminés. Cela peut être un avantage dans l'étude de premiers effets afin de neurones, ainsi que d'un inconvénient puisque les connexions et les processus physiologiques sont perdus.
Un facteur limitant dans les deux patch clamp électrophysiologie et d'imagerie de colorant MPD / de calcium est la nécessité d'utiliser de jeunes animaux (souris, par exemple. <Ou rats âgés de 8 semaines). C'est principalement en raison de l'augmentation du tissu conjonctif en combinaison avec la viabilité neuronale diminué qui se produit avec l'âge. Dans le cerveau tranche électrophysiologie goujons, une augmentation du tissu conjonctif, il est plus difficile de visualiser les neurones. Tissu conjonctif accrue rend également plus difficile de dissocier un grand nombre de neurones sains pour les études d'imagerie. En outre, les neurones de jeunes animaux survivent plus longtemps pendant l'enregistrement ou l'imagerie patch clamp. Cependant, l'utilisation de jeunes souris peut être une limitation majeure. L'activité et / ou de réponses à des neurotransmetteurs ou des nutriments circulent neuronale changent avec l'âge. Par exemple, depuis le bilan énergétique est étroitement liée à l'état reproducteur, les neurones hypothalamiques régulant la balance énergétique peuvent réagir différemment en pré-vs animaux après la puberté. En outre, de nombreuses maladies nécessitent un traitement à long terme ou ne manifestent pas avant l'âge adulte. Les principaux exemples de ces maladies sont l'obésité alimentaire ou diabète de type 2. Depuis neurones glucose de détection sont soupçonnés de jouer un rôle dans ces maladies, nous avons développé une méthodologie pour la culture de succès adultes sains neurones HVM pour une utilisation dans l'imagerie de MPD experiments.
Protocol
Representative Results
Discussion
La clé pour être en mesure d'étudier l'activité des neurones de souris adultes est la capacité de dissocier les neurones sains. La dissociation des neurones hypothalamiques de souris adultes est plus difficile à plusieurs étapes clés du protocole par rapport aux neurones de souris juvéniles. Nous avons surmonté ce problème dans un certain nombre de façons. Faire des tranches épaisses de 500 um de cerveau minimise les dégâts mécaniques aux neurones par rapport aux habituels 250-350 um tranches uti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063
Materials
| Neurobasal-A Medium (Custom) | Invitrogen | 0050128DJ | custom made glucose free |
| Hibernate-A Medium (Custom) | BrainBits | custom made glucose free | |
| Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | other vendors acceptable |
| Stericup vacuum filter units (0.22 μm) | Millipore | other vendors acceptable | |
| 25 mm Glass coverslips | Warner | #1 25mm round | |
| 18 mm Glass coverslips | Warner | #1 18mm round | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
| B27 minus insulin (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
| Razor blade | VWR | 55411 | |
| Vibratome & cooling chamber | Vibratome | Series 1000 Sectioning system | |
| Vibratome blades | Polysciences | 22370 | injector or double edge blades from other vendors acceptable |
| Papain, suspension | Worthington | LS003124 | |
| BSA, suitable for cell culture | Sigma | other vendor acceptable | |
| DNAse, for cell culture | Invitrogen | other vendor acceptable | |
| cloning cylinders, 6 mm x 8 mm | Bellco Glass | 2090-00608 | |
| Membrane Potential Dye (blue) | Molecular Devices | R8042 | |
| In-line heater | Warner | SF-28 | |
| Syringe pumps | WPI | sp100i | other vendor acceptable |
| Closed chamber | Warner | RC-43C | |
| Polyethylene tubing | Warner | PE-90 | |
| Metamorph | Molecular Devices | alternate image analysis software acceptable | |
| Microscope | Olympus | BX61 WI |
used with 10X objective |
| Camera | Photometrics | Cool Snap HQ | |
| Narrow Cy3 Filter Set | Chroma | 41007a | |
| Illumination System | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
References
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- Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).
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