막 성인 쥐에서 Ventromedial 시상 하부 뉴런의 잠재적 인 염료 이미징은 포도당 감지를 연구하는
Summary
성인 세 마우스의 단일 뉴런의 활동은 특정 뇌 영역에서 신경 세포를 해리와 형광 막 잠재적 인 염료 이미징을 사용하여 공부하실 수 있습니다. 포도당의 변화에 시험 응답으로,이 기술은 성인 ventromedial 시상 하부 뉴런의 포도당 민감성을 연구하는데 사용될 수있다.
Abstract
신경 세포의 활동에 대한 연구는 종종 증가로 인해 결합 조직과 관련된 기술적 인 문제에 설치류 생후 2 달 이상에서 신경 세포를 사용하여 수행하고 나이가 발생하는 신경 세포의 생존 능력을 감소합니다. 여기, 우리는 성인 세 마우스의 건강한 시상 하부 신경 세포의 분리를위한 방법을 설명합니다. 성인 나이 든 쥐에서 신경 세포를 연구 할 수있는 능력은 나중에 나이에 명시 특정 연구에 대한 더 많은 발달 정확한 수 있습니다 질병 모델의 사용을 할 수 있습니다. 단일 신경 세포를 연구하는 전기 생리학을 사용하는 것이 아니라 해리 뉴런의 형광 이미징은 뉴런 집단의 활성을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 원하는 신경 세포의 종류는 시상 하부의 포도당 감지 신경 세포에 대한 희귀되는 이기종의 연결 인구를 공부 할 때 특히 유용합니다. 우리는 차에 자신의 반응을 연구하는 성인 ventromedial 시상 하부의 신경 세포의 막 잠재적 인 염료 영상을 활용세포 포도당 nges. 포도당 감지 뉴런 에너지 균형의 조절에 중심적인 역할을하는 것으로 생각된다. 성인 설치류에서 포도당 감지 기능을 연구 할 수있는 능력은 장애 에너지 균형 (예. 비만) 연령 증가와 관련된 질병의 우세 이후에 특히 유용합니다.
Introduction
뇌는 신경 내분비 및 자율 신경 시스템을 통해 에너지 항상성을 조절한다. ventromedial 시상 하부 (VMH)에 ventromedial 핵 (VMN) 및 아치형 핵 (ARC)으로 구성된 에너지 항상성의 중추 조절에 중요하다. 전문 포도당 감지 뉴런은 VMH 내에서 신경 세포의 활동과 주변 포도당 항상성 1을 연결합니다. 포도당 여기 (GE) 포도당 (GI) 신경 세포의 포도당이 증가함에 따라 자신의 활동을 감소 억제하면서 신경 세포가 증가, 신경 세포를 감지하는 포도당의 두 가지 유형이 있습니다. VMH 포도당 감지 신경 세포는 일반적으로 전기 생리학 또는 칼슘 / 막 잠재력에 민감한 염료의 이미지를 사용하여 연구한다.
전기 생리학 패치 클램프 기술은 생체 신경 세포 활동의 연구에서 황금 표준으로 간주됩니다. 이 기술에서는, 유리 마이크로 피펫 전극은 높은 저항을 통해 세포막에 부착(GΩ) 인감. 패치 클램프 전극은 활동 전위의 주파수 (전류 클램프) 또는 이온 전도도 (전압 클램프)의 실시간 기록은 단일 신경 세포 내에서 변경 가능. 패치 클램프 기술은 특정 이온 채널 컨덕턴스의 변화에 관한 상세 정보를 제공하는 반면, 주요 단점은 하나의 신경 세포가 동시에 관찰 할 수 있다는 것이다. 심지어 특정 실험 치료를 시작하기 전에 포도당 감지 신경 세포에서 하나가 기록되어 있는지 확인하기 위해 기록의 약 30 ~ 45 분입니다. 또한, GI와 GE 뉴런은 <총 VMH의 신경 인구의 20 %를 포함한다. 이 문제를 복잡하게하는 것은 이들 뉴런 세포 마커의 식별 많은 경우에 부족이다. 따라서, 클리어 다른 기법, 패치 클램프 분석 힘드는 수 없다는 귀중한 전기 정보, 시간 소모 및 낮은 수율을 제공에도 불구.
해리 VMH 뉴런의 형광 이미징의 사용은 HU의 연구를 허용동시에 신경 세포의 ndreds. 칼슘 민감 염료 간접적 신경 활성의 변화와 상관이 세포 내 칼슘의 변화를 측정 할 수있다. 막 잠재력에 민감한 염료 막 잠재적 인 변경 사항을 모니터링하는 데 사용됩니다. 세포막 전위 측정은 세포 내 칼슘 수준의 변화에 비해 신경 활성의 직접적인 지표이다. 또한, 막 잠재적 인 염료 (MPD) 영상은 잠재적으로 활동 전위 발사가 변경되지 않고 세포 내 칼슘 수준이 변경되지 않을 수 있습니다 막 전위에서 작은 변화를 감지합니다. 이러한 형광 이미징 기술은 모두 청소년 마우스 2-7에서 VMH 포도당 감지 신경 세포를 연구하는 데 사용되었습니다. 결과 패치 클램프 전기 생리학에 의한 것 이상 상세한 있지만, 영상 실험의 강도는 동시에 필연적으로 포도당 감지 신경 세포의 상당수를 포함 세포의 많은 인구를 평가하는 것입니다. MPD 이미징 I더 전체에 균일 VMH에 걸쳐 현지화 GI 신경을 공부에 특히 유용들, 따라서 해리 VMH (~ 15 % GI)에서 공부하는 적절한 인구를 제공한다. GE의 신경 세포가 밀집 ventrolateral-VMN와 ARC와 VMN 사이에 셀별로 지역 언어로 번역하면서 반면에, 그들은 VMH 내에서 신경 세포의 상당수 (<1 % GE)을 대표하지 않습니다. 또한, 고립 된 신경 세포를 연구함으로써, 성상 세포와 시냅스 효과가 제거됩니다. 연결 및 생리적 과정이 손실되기 때문에 이것은 일차 신경 효과를 연구하는 장점뿐만 아니라 단점이 될 수있다.
패치 클램프 전기 생리학 및 MPD / 칼슘 염료 영상 모두에서 제한 요인은 젊은 동물 (예. 마우스 또는 쥐 <8 주령)를 사용할 필요가있다. 이는 나이가 발생 감소 신경 세포의 생존 능력과 함께 증가 된 결합 조직에 주로있다. 뇌 슬라이스 전기 생리학 스터드이거, 증가 된 결합 조직은 더 어려워 신경을 시각화 할 수 있습니다. 증가 된 결합 조직은 어렵게 이미징 연구를위한 건강한 뉴런의 큰 숫자를 해리 할 수 있습니다. 또한, 젊은 동물의 뉴런은 패치 클램프 녹음 또는 영상 중 하나를하는 동안 더 이상 생존. 그러나, 어린 마우스의 사용이 중요한 제한 될 수있다. 신경 세포의 활동 및 / 또는 신경 전달 물질 또는 순환 영양소에 대한 응답은 연령에 따라 변경합니다. 에너지 균형 밀접 생식 상태에 연결되어 있기 때문에 예를 들어, 에너지 균형을 조절하는 시상 하부 뉴런 postpubescent 동물 사전 VS에 다르게 응답 할 수있다. 또한, 많은 질병은 장기 치료를 필요로하거나 성인이 될 때까지 명시하지 않습니다. 이러한 질병의 국무 예는식이 비만이나 2 형 당뇨병이다. 포도당 감지 신경 세포는이 질병에있는 역할을 할 것으로 생각하고 있기 때문에 우리는 성공적으로 MPD 이미징 특급에 사용하기 위해 건강한 성인 VMH의 신경 세포를 배양하기위한 방법론을 개발eriments.
Protocol
Representative Results
Discussion
성인 쥐에서 신경 세포의 활동을 연구 할 수있는 열쇠는 건강한 신경 세포를 해리 할 수있는 기능입니다. 성인 마우스의 시상 하부 신경 세포의 분리 청소년 쥐에서 신경 세포에 비해 프로토콜의 몇 가지 주요 단계에서 더 어렵습니다. 우리는 여러 가지 방법으로이 문제를 극복했다. 두께 500 μm의 뇌 조각을 만들기 젊은 쥐에서 뇌 조직에 사용되는 보통 250 ~ 350 μm의 슬라이스에 비해 신경 세?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063
Materials
| Neurobasal-A Medium (Custom) | Invitrogen | 0050128DJ | custom made glucose free |
| Hibernate-A Medium (Custom) | BrainBits | custom made glucose free | |
| Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | other vendors acceptable |
| Stericup vacuum filter units (0.22 μm) | Millipore | other vendors acceptable | |
| 25 mm Glass coverslips | Warner | #1 25mm round | |
| 18 mm Glass coverslips | Warner | #1 18mm round | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
| B27 minus insulin (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
| Razor blade | VWR | 55411 | |
| Vibratome & cooling chamber | Vibratome | Series 1000 Sectioning system | |
| Vibratome blades | Polysciences | 22370 | injector or double edge blades from other vendors acceptable |
| Papain, suspension | Worthington | LS003124 | |
| BSA, suitable for cell culture | Sigma | other vendor acceptable | |
| DNAse, for cell culture | Invitrogen | other vendor acceptable | |
| cloning cylinders, 6 mm x 8 mm | Bellco Glass | 2090-00608 | |
| Membrane Potential Dye (blue) | Molecular Devices | R8042 | |
| In-line heater | Warner | SF-28 | |
| Syringe pumps | WPI | sp100i | other vendor acceptable |
| Closed chamber | Warner | RC-43C | |
| Polyethylene tubing | Warner | PE-90 | |
| Metamorph | Molecular Devices | alternate image analysis software acceptable | |
| Microscope | Olympus | BX61 WI |
used with 10X objective |
| Camera | Photometrics | Cool Snap HQ | |
| Narrow Cy3 Filter Set | Chroma | 41007a | |
| Illumination System | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
References
- Routh, V. H. Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant?. Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).
- Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).
- Canabal, D. D., et al. Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).
- Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).
- Murphy, B. A., et al. Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).
- Kang, L., et al. Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing. Diabetes. 55, 412-420 (2006).
- Kang, L., et al. Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons. Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1998).
- Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).
- Song, Z., Routh, V. H. Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 54, 15-22 (2005).
