Använda Coculture att upptäcka Kemiskt medierade mellan arter Interaktioner

Summary

Bakterier producerar utsöndrade föreningar som har potential att påverka fysiologi deras mikrobiella grannar. Här beskriver vi en coculture skärm som tillåter detektion av sådana kemiskt medierade mellan arter interaktioner genom att blanda jordmikrober med fluorescerande transkriptions reporter stammar av Bacillus subtilis på fasta medier.

Abstract

I naturen, bakterier förekommer sällan isolerat, de är istället omges av en mångfald av andra mikroorganismer som förändrar den lokala miljön genom att utsöndra metaboliter. Dessa metaboliter har potential att modulera fysiologi och differentiering av deras mikrobiella grannar och är sannolikt viktiga faktorer för upprättande och underhåll av komplexa mikrobiella samhällen. Vi har utvecklat en fluorescens-baserade coculture skärmen för att identifiera sådana kemiskt medierade mikrobiella interaktioner. Skärmen innebär en kombination av ett fluorescerande transkriptionell reporter stam med miljö mikrober på fasta medier och låta kolonierna att växa i samodling. Den fluorescerande transkriptionell reportern är utformad så att den valda bakteriestammen fluorescerar när den uttrycker en speciell fenotyp av intresse (dvs. bildning av biofilm, sporulering, virulensfaktor produktion etc.) Screening utförs under tillväxtbetingelser where denna fenotyp uttrycks inte (och därför reportern stam är vanligtvis icke-fluorescerande). När en miljö mikrob utsöndrar en metabolit som aktiverar denna fenotyp, diffunderar det genom agar och aktiverar den fluorescerande reporterkonstruktionen. Detta gör att förmå-metaboliten producerande mikrob som ska detekteras: de är de icke-fluorescerande kolonier mest proximala till de fluorescerande kolonier. Således gör denna skärm identifiering av miljö mikrober som producerar diffunderbara metaboliter som aktiverar en viss fysiologisk reaktion på en reporter stam. Denna publikation beskriver hur du: a) välja lämpliga coculture screening förhållanden, b) förbereda reporter och miljö mikrober för screening, c) utföra coculture skärmen, d) isolera förmodade framkallande organismer, och e) bekräftar sin verksamhet i en sekundär skärm. Vi utvecklade denna metod för att screena för markorganismer som aktiverar biofilm matrix-produktion i Bacillus subtilis </em>, men vi diskuterar också överväganden för att tillämpa detta synsätt på andra genetiskt tractable bakterier.

Introduction

Vi är intresserade av att förstå hur de metaboliter som bakterierna utsöndrar påverkar fysiologi och utveckling av grann mikrober. Många metaboliter har karakteriserats för sina bioaktiva effekter på andra mikrober. Två väl beskrivna exempel innefattar antibiotika, vilka inhiberar tillväxten av andra mikroorganismer och quorum sensing molekyler, vilka ändrar det globala genuttrycket av andra mikrober. Men bakterier producerar många andra små molekyler naturliga produkter som inte har några kända bioaktiviteter ^1. Vår hypotes är att bakterier har utvecklats och bevarat förmågan att producera några av dessa metaboliter eftersom de tillåter dem att modulera cellulär fysiologi för sina mikrobiella grannar i de komplexa mikrobiella samhällen inom vilka de flesta bakterier finns.

Typer Bacillus subtilis cell

Vi har fokuserat våra studier på kemiskt medierade mikrobiella interaktioner som involverar bacillus subtilis. Detta är inte bara på grund av sin status som grampositiva modell bakterie och de resulterande genetiska verktyg som finns för dess manipulation, utan också på grund av dess förmåga att differentiera till karakteriseras celltyper. Exempel är celler som är: simning, som producerar den extracellulära matrisen som krävs för robust biofilmsbildning, som är behöriga att ta upp DNA från omgivningen, och sporbildande, bland annat ^2. Var och en av dessa celltyper uttrycker en karakteristisk transkription regulon som gör dem fysiologiskt och / eller fysiskt skilda från sina genetiskt identiska syskon. Under många tillväxtförhållanden, flera celltyper samexistera så olika subpopulationer i en enda koloni av B. subtilis-celler ^3. Även om många arter av bakterier kan uppvisa motsvarande celltyp heterogenitet, detta fenomen har särskilt studerats i B. subtilis.

I synnerhet kan gener som är UPRegulated inom var och en av dessa specifika B. subtilis celltyper har identifierats. Identifiera sådana uppreglerade gener är avgörande för det arbete som beskrivs här eftersom många av dessa mikrobiella fenotyper av intresse är svåra eller omöjliga att observera direkt. Till exempel kan vi inte visuellt upptäcka en egenskap såsom simning på fasta (1,5%) agarplattor, trots att en subpopulation av B. subtilis celler producerar flag under dessa förhållanden ^3. Ett annat exempel är biofilm matrix-produktion. Matrix produktion kan visualiseras genom kolonimorfologi (eftersom det resulterar i makroskopiskt rynkig kolonier), men bara på vissa tillväxtmedium, och först efter flera dagar av tillväxt ^4. Men genom att veta vilka gener som uppregleras under differentiering, kan vi konstruera transkriptions reportrar som fungerar som markörer för celldifferentiering i dessa celltyper.

Reporterkonstruktioner

Dessa fluorescerande transcriptional reportrar består av promotorerna för cell-typ specifika gener som driver produktion av en reportergen, t ex ett fluorescerande protein. Exempel innefattar P _hag-YFP (för att bada celler), P _TAPA-YFP (för biofilm matrix-producerande celler), och P _SSPB-YFP (till sporbildande celler), där P _{^ anger} promotorregionen för genen x. Dessa reporterkonstruktioner är integrerade i en neutral-lokuset på kromosomen (Figur 1 och se nedan), så att den naturliga regleringen av fenotypen lämnas intakt. Men nu, när en cell uttrycker denna fenotyp uttrycker det också ett fluorescerande protein. Detta ger en lätt visualiseras avläsning av aktiveringen av särskild fenotypisk beteende, vilket tillåter oss att screena för mikrober som aktiverar denna fysiologisk respons. Även om sådana reportrar är vanliga i mikrobiologi, de har inte varit i stort sett tillämpas på skärmar till identify metaboliska interaktioner mellan mikrober innan denna metod beskrivs ^5.

Det finns ett antal viktiga överväganden vid konstruktion och tillverkning av cell-typspecifika reporter stammar. Vi har använt uteslutande transkriptions fluorescerande reportrar, även om andra typer av konstruktioner är säkert möjligt. Vi motverka användning av translationella fusioner som markörer för celltyp differentiering i vår skärm, men av två skäl: 1) en önskan att lämna den infödda cell-typ-specifikt protein oberörd, och 2) det erkännande som en diffus, cell- breda fluorescens blir lättare att upptäcka än lokaliserad puncta inom celler (gemensamt med translationella fusioner).

Reporter selektionsgenen

Efter att ha beslutat att använda transkription som en avläsning, måste reportergenen väljas (t.ex. LacZ, fluorescens, eller luciferas). LacZ har fördelen av att behöva den minst speciellaized utrustning för att upptäcka, men det finns en mycket högre sannolikhet för falska positiva bland miljö mikrober. I våra händer, bakgrundsnivån av Lac ⁺ organismer bland jordmikrober var oöverkomligt hög (>> 10% av jordmikrober var blå (Lac ⁺⁾ på X-gal-plattor, data ej visade). Det är möjligt att genom att titrera den koncentration av X-gal i mediet, kan detta optimeras för att tillåta användning av en X-gal-reportern, även om vi inte försöka detta. Luciferas ger hög känslighet för upptäckt och är den ortogonala reporter: det finns nästan ingen chans att miljö mikrober är till sin natur självlysande. Men vi fann det svårt att identifiera instrumentering vid vår institution som tillät luminiscens upptäckt över hela Petri plattor, eftersom de flesta var utformade för att skanna endast lokala områden i flerbrunnsplattor. Det kan också finnas komplikationer i visualisera självlysande kolonier på ett sätt som också tillät samtidigt är fysiskt ärolation inducera organismer. När du använder förvaltare kan ha gjort detta möjligt, vi istället valt att använda fluorescerande transkriptions reportrar, som visat sig fungera i B. subtilis, förutsatt tillräcklig känslighet för detektering och låga falska positiva värden bland jordorganismer, och tillåts använda av lätt tillgänglig instrumentering för både visualisering och isoleringsförfaranden.

Fluorofor urval

Den specifika fluoroforen väljs beror på dina bakteriearter, den agar odlingsmedium som används, och den särskilda fluorescensfiltret sätter du har tillgängligt. Med vår instrumentering, fann vi att både B. subtilis kolonier själva och ägarn de odlades på uppvisade mindre bakgrundsfluorescens när YFP (yellow fluorescent protein) filter användes, vilket gör att reportern överlägsen till GFP (grönt fluorescerande protein) i våra händer. Den kodonanvändning av fluorescerande proteiner ärofta optimerade för eukaryoter, vilket gör det viktigt att välja en fluorofor antingen känd från litteraturen för att arbeta i din bakteriearter, eller för att testa den explicit med hjälp av en konstitutiv promotor. Ett stort antal ständigt föränderliga fluorescerande proteinvarianter finns idag ^6, som har granskats i ett antal källor ^7,8, varav en del ger explicit vägledning om att välja en lämplig fluorescerande protein för experimentet ^9.

Promoter urval

Valet av en promotor kommer till stor del att bero på din celltyp eller fenotyp av intresse. För sådana organismer som B. subtilis har vissa cell-typspecifika reportergener visats i litteraturen. För andra bakteriestammar, kommer att undersöka microarray eller transkriptions uppgifter vara nödvändiga för att ge information om vilka gener som är högt uppregleras under de förhållanden där din cell typ av intresse is manifesterade. En nyligen genomförd studie katalogis transkriptionen av B. subtilis inom 104 olika tillväxtförhållanden med hjälp av kakel microarrays ^10. Detta dokument ger omfattande information om vilka gener som är mycket uppregleras under olika förhållanden, vilket är ovärderligt för mindre väl karakteriserade fenotyper.

Hellre än att kartlägga exakta promotorregionerna för varje gen av intresse, vi typiskt helt enkelt använda sekvensen 200 till 500 bp uppströms om genen som promotorn. Den exakta sekvenslängden beror på den genomiska sammanhang: kortare regioner används vid behov för att undvika att även uppströms kodande regioner från angränsande öppna läsramar.

Neutral loci och integration

Hur att upprätthålla reporterkonstruktionen i din bakteriestam blir den sista frågan i utformningen av ett fluorescerande transkriptions reporter stam. I bakterier har gener av intresse ofta bibehållaspå plasmider med användning av antibiotikaselektion. Dock kan det inte vara möjligt att använda antibiotika under coculture utan att döda miljö mikrober. Om plasmider stabilt bibehålls i din bakteriearter, kan det vara möjligt odla dina bakterier som innehåller en plasmid burna reporter i närvaro av antibiotika för att förbereda din reporter för screening, och sedan eliminera antibiotika under samodlingen sig i hopp om att plasmiden kommer i tillräcklig utsträckning kan bibehållas för att medge fluorescens. Men om plasmider lätt vilse i din bakterie, eller försvinner under stressförhållanden, detta kommer inte att vara ett hållbart alternativ. I många fall är den bästa lösningen vara att integrera den reporterkonstruktion på den bakteriella kromosomen, som möjliggör stabilt upprätthållande av reporter även i avsaknad av selektion. För att integrationen att inte störa den normala uttryck eller reglering av din gen av intresse, rekommenderar vi att integreras i en ektopisk plats på kromosomen som can fungera som en "neutral locus." I B. subtilis dessa integrations platser är gener som – när muterat – förmedla en fenotyp i viss minimal media (vilket gör integranter identifieras utan antibiotikaselektion), men ändå inte ändrar tillväxt eller sporulering priser i rika medier, och inkludera sådana gener som amyE, Laca, thrC, pyrD, gltA och SACA (transport förmågan att använda stärkelse, β-galaktosider, treonin, uracil, glutamat, och sackaros, respektive) ^11-13.

Även om integrationen i dessa gener har använts på ett tillförlitligt sätt under många år i B. subtilis (särskilt i amyE och Laca), kan motsvarande kunskaper inte är tillgänglig för gener i många andra bakteriearter. Användningen av fag bindningsställen är bra alternativ för neutrala kromosomplatser integrations: många artspecifika ^14-16, samt allmänna platser integrations såsom fäst webbplatsen Tn7 (ATT Tn7) haridentifierats och använts för geninsertioner i många bakteriearter ^17,18.

Miljö mikrober

Vi använder marken som en direkt källa till miljö mikrober för vår coculture skärmen. Den jord som innehåller en stor mångfald av mikrober, och många av dessa organismer är rik källa av naturliga produkter. Genom att använda flytande suspensioner av jord placeras direkt på plåtar med vår fluorescerande transkription reporter stam (utan föregående isolering av bakterier från jorden), vi förenkla den experimentella tillvägagångssätt. Marken kan antingen användas direkt efter skörd, eller frysas vid -80 ° C för framtida bruk. Omedelbar användning har fördelen att en större mångfald av mikrober kan potentiellt odlas, inklusive de som inte överlever frysning bra. Den har den nackdelen att koncentrationen av odlingsmarkorganismer från dessa prover är okänd, vilket ökar antalet skärmplåtar som måste användas. DelAyed användning har den fördelen att de cfu / ml för varje jordkälla kan fastställas i förväg, så att en optimerad antal kolonier som odlas på varje skärm platta. Det kräver dock att markorganismerna kunna överleva frysning.

Observera att diversifiera inducerare poolen som undersöks (dvs. markens källor) tycks vara mer effektiva på att identifiera nya mellan arter interaktioner än fördjupad undersökning på samma mark: ökad fylogenetiska mångfalden observerades i de träffar som identifierats i vår matris-induktions skärmen som ytterligare markkällor undersöktes snarare än screening samma jordkällorna mer noggrant (EA Shank och R. Kolter, Harvard Medical School, opublicerade resultat).

Översikt

Den metod vi beskriver här är okomplicerad när det gäller de tekniska kraven. Det handlar om: 1) konstruktion av en fluorescerande transkriptions reporter i B. subtilis eller enandra bakteriearter av intresse, 2) identifiera vilka villkor denna reporter inte är aktiverad, 3) förbereda alikvoter av denna reporter stam och organismer som ska screenas (i vårt fall jord, men andra källor skulle kunna användas i stället), 4) att blanda dessa två uppsättningar av mikrober på fasta medier, 5) identifiera och isolera förmodade framkallande organismer, och 6) som bekräftar att dessa organismer verkligen aktiverar denna fenotyp i en sekundär skärm. När detta har skett, dessa organismer och deras metaboliter förse oss med kemiska verktyg för att modulera bakterie beteende, för att studera bakteriell fysiologi och mikrobiella interaktioner, och att eventuellt fungera som nya ställningar för framtida terapeutiska föreningar.

Protocol

1. Välj en Reporter Gene och Konstruera en fluorescerande Transkriptionell Reporter För B. subtilis: Se JUPITER artikeln i ett protokoll som beskriver konstruktionen av fluorescerande transkriptions reportrar i Bacillus subtilis referens 19. För andra bakteriearter: Identifiera en gen, som uppregleras under den fysiologiska responsen av intresse. Detta kan baseras på befintlig litteratur elle…

Representative Results

Denna skärm användes för att identifiera markorganismer utsöndrar läkemedel som förändrar fysiologi B. subtilis. De resultat som beskrivs här att inriktas på matrisen producerande celltyp för B. subtilis, som producerar proteinet och exopolysackarid som krävs för robust biofilmbildande i denna bakterie. Vi valda promotorn för TAPA-sipW-tasa operonet för vår fluorescerande reporterkonstruktionen (P TAPA-YFP). Denna operon kodar för proteinet strukturell kompo…

Discussion

En av de inneboende begränsningarna i detta protokoll är att det bygger på cultivability av mikrobiella organismer. Såsom är väl dokumenterade ^24, mest mikrobiellt liv på planeten kan inte (ännu) inte odlas under odlingsbetingelserna utforskas hittills. Således kommer ett stort antal interaktioner mellan mikrobiella arter som förekommer i naturliga inställningar inte upptäcks med hjälp av denna metod. Men eftersom vår önskan är att inte bara identifiera förekomsten av sådana interaktioner, m…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Spectrophotometer			Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.
Luria broth, Lennox	VWR	80017-484	Alternative media sources may be necessary.
Glass beads, 3 mm	VWR	26396-508
Gel loading tips, round	VWR	29442-666
Glass rods	VWR	59060-069
Fluorescence dissecting stereoscope	Zeiss	N/A	The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.