Usando Coculture detectar quimicamente mediada interespécies Interações

Summary

As bactérias produzem compostos secretados que têm o potencial de afetar a fisiologia de seus vizinhos microbianas. Aqui nós descrevemos uma tela de co-cultura, que permite a detecção de tais quimicamente mediadas entre espécies interações misturando os micróbios do solo com cepas repórter transcrição fluorescentes de Bacillus subtilis em meios sólidos.

Abstract

Na natureza, as bactérias raramente existem isoladamente, pois eles estão em lugar cercado por um conjunto diversificado de outros microorganismos que alteram o meio ambiente local através da secreção de metabólitos. Estes metabolitos têm o potencial de modular a fisiologia ea diferenciação de seus vizinhos microbiana e são prováveis ​​fatores importantes para a criação e manutenção de comunidades microbianas complexas. Nós desenvolvemos uma tela à base de co-cultura de fluorescência para identificar tais interacções microbianas quimicamente mediados. A tela envolve a combinação de uma transcrição repórter tensão fluorescente com micróbios ambientais em meios sólidos e permitindo que as colônias de crescer em co-cultura. O repórter transcricional fluorescente é projetado de modo que a estirpe bacteriana escolhido fluorescência quando é expressar um fenótipo de interesse particular (ou seja, a formação de biofilme, esporulação, a produção de fator de virulência, etc.) A triagem é realizada sob condições de crescimento where este fenótipo não é expresso (e, por conseguinte, a estirpe repórter é tipicamente não fluorescente). Quando um micróbio ambiental segrega um metabolito que activa este fenótipo, difunde-se através do ágar e ativa a construção repórter fluorescente. Isto permite que a indução de-produzir metabolito micróbio para ser detectado: eles são as colónias não fluorescentes mais proximais às colónias fluorescentes. Assim, esta tela permite a identificação de micróbios ambientais que produzem metabólitos difusíveis que ativam uma resposta fisiológica especial em uma cepa repórter. Esta publicação aborda como: a) selecionar as condições de co-cultura de rastreio adequados, b) preparar o repórter e micróbios ambientais para o rastreio, c) executar a tela de co-cultura, d) isolar putativo induzindo organismos, e e) confirmar a sua atividade em uma tela secundária. Nós desenvolvemos este método para triagem de organismos do solo que ativam biofilme matriz de produção em Bacillus subtilis </em>, no entanto, também discutimos considerações para aplicar esta abordagem a outras bactérias geneticamente tratáveis.

Introduction

Estamos interessados ​​em compreender como os metabólitos que as bactérias segregam afetam a fisiologia eo desenvolvimento de micróbios vizinhos. Muitos metabolitos têm sido caracterizados pelos seus efeitos bioactivos sobre os outros micróbios. Dois exemplos bem descritos incluem os antibióticos, os quais inibem o crescimento de outros micróbios e as moléculas de quorum sensing, que alteram a expressão génica global de outros micróbios. No entanto, as bactérias produzem muitos outros produtos naturais de moléculas pequenas que não têm bioatividades conhecidos ^1. Nós supomos que as bactérias têm evoluído e preservada a capacidade de produzir alguns destes metabolitos porque lhes permitem modular a fisiologia celular de seus vizinhos microbianos nas comunidades microbianas complexas dentro do qual a maioria das bactérias existentes.

Tipos de células de Bacillus subtilis

Nós nos concentramos nossos estudos sobre as interações microbianas quimicamente mediadas que envolvem Bacilsubtilis lus. Isto não é só por causa de seu status como a bactéria modelo Gram-positivas e as ferramentas genéticas resultantes disponíveis para sua manipulação, mas também devido à sua capacidade de se diferenciar em tipos de células caracterizadas. Exemplos incluem células que são: natação; produzem a matriz extracelular que é necessária para a formação de biofilme robusta; competentes para tomar-se o ADN a partir do ambiente, e esporulação, entre outros, ^2. Cada um destes tipos de células expressa um regulão transcricional característica que torna fisiologicamente e / ou fisicamente distintos dos seus irmãos geneticamente idênticos. Sob muitas condições de crescimento, vários tipos de células como coexistir várias subpopulações dentro de uma única colónia de B. células subtilis ^3. Embora muitas espécies de bactérias podem apresentar análogo tipo de célula heterogeneidade, esse fenômeno tem sido particularmente bem estudada em B. subtilis.

Em particular, os genes que são upregulated dentro de cada uma delas específica B. tipos celulares subtilis foram identificados. A identificação de tais genes regulados positivamente é essencial para o trabalho aqui descrito, porque muitos destes fenótipos microbianos de interesse são difíceis ou impossíveis de se observar directamente. Por exemplo, não podemos detectar visualmente um traço, como natação em sólidos (1,5%) placas de ágar, apesar de uma subpopulação de B. células subtilis produzir flagelos nessas condições ^3. Um outro exemplo é a produção de matriz de biofilme. Produção Matrix pode ser visualizado por morfologia da colônia (pois resulta em colônias macroscopicamente enrugados), mas apenas em determinado meio de crescimento, e só depois de vários dias de crescimento ^4. No entanto, sabendo que os genes são regulados positivamente durante a diferenciação, podemos construir os repórteres de transcrição que actuam como marcadores de diferenciação celular para estes tipos de células.

Construções repórter

Estes fluorescente trepórteres ranscriptional constituído pelos promotores de genes específicos do tipo de células conduzindo a produção de um gene repórter, por exemplo, uma proteína fluorescente. Exemplos incluem P _hag-YFP (para natação células), P _Tapa-YFP (para as células produtoras de matriz do biofilme), e P _SSPB-YFP (por esporulação células), onde P _x indica a região do promotor para o gene de x. Estas construções repórter são integrados em um locus neutro no cromossoma (Figura 1 e ver abaixo) de modo a que a regulação natural do fenótipo é deixada intacta. No entanto, agora, quando uma célula expressa este fenótipo, que também expressa uma proteína fluorescente. Isso proporciona uma leitura fora facilmente visualizado da ativação de determinado comportamento fenotípica, permitindo-nos para triagem de micróbios que ativam esta resposta fisiológica. Embora tais repórteres são comumente usados ​​em microbiologia, eles não têm sido amplamente aplicada em telas para identifinterações metabólicas y entre micróbios antes deste método foi descrito ^5.

Há uma série de considerações importantes na concepção e construção de linhagens de células-repórter específicos do tipo. Utilizamos repórteres fluorescentes exclusivamente de transcrição, embora outros tipos de construções são certamente possível. Nós desencorajamos o uso de fusões traducionais como marcadores para diferenciação tipo de célula em nossa tela, no entanto, por duas razões: 1) o desejo de deixar o tipo específico de célula proteína nativa imperturbável, e 2) o reconhecimento de que uma difusa, célula- grande fluorescência será mais fácil de detectar do que puncta localizada no interior das células (comum com fusões de translação).

Selecção do gene repórter

Após decidir usar a transcrição de um-para ler, o gene repórter tem de ser seleccionada (por exemplo, LacZ, fluorescência, ou luciferase). LacZ tem a vantagem de necessitar de menos especializado equipamento para detectar, mas há uma probabilidade muito maior de falsos positivos entre os micróbios ambientais. Nas nossas mãos, o nível de Lac ⁺ organismos entre os micróbios do solo do fundo era proibitivamente alta (>> 10% de micróbios do solo eram azuis (Lac ⁺⁾ em placas de X-gal, dados não mostrados). É possível que por titulação da concentração de X-gal no meio, isto pode ser optimizado para permitir a utilização de um repórter com X-gal, mas não esta tentativa. Luciferase oferece alta sensibilidade de detecção e é a repórter mais ortogonal: não há quase nenhuma chance de micróbios ambientais sendo luminescente inerentemente. No entanto, descobrimos que é difícil identificar instrumentação em nossa instituição que permitiu a detecção de luminescência através de placas de Petri inteiras, como a maioria foi projetado para digitalizar regiões localizadas apenas em placas de multi-bem. Também pode haver complicações em visualizar colônias luminescentes de uma maneira que também permitiu a física simultânea éolation de organismos indutores. Enquanto estiver usando fiduciários pode ter feito isso possível, nós em vez optou por usar repórteres transcricionais fluorescentes, que foram provados trabalhar em B. subtilis, uma sensibilidade adequada e de detecção de baixas taxas de falsos positivos entre os organismos do solo, e deixou-se o uso de instrumentação facilmente disponível para visualização e os procedimentos de isolamento.

Seleção Fluoróforo

O fluoróforo específico escolhido dependerá de suas espécies de bactérias, o meio de crescimento agar você está usando, eo filtro de fluorescência especial define que você tem disponível. Com a nossa instrumentação, descobrimos que tanto o B. subtilis colônias si e do ágar foram cultivadas em exibiram fundo menos fluorescência quando foram usados ​​filtros YFP (proteína fluorescente amarela), fazendo com que o repórter superior a GFP (proteína fluorescente verde) em nossas mãos. A utilização do codão de proteínas fluorescentes sãofreqüência otimizada para eucariotos, tornando-se importante para selecionar um fluoróforo ou conhecidos da literatura para trabalhar em suas espécies bacterianas, ou para testá-lo explicitamente usando um promotor constitutivo. Um grande número de constante evolução variantes da proteína fluorescente estão disponíveis ^6, que foram revistas em uma série de fontes de ^7,8, alguns dos quais prevêem expressamente a orientação sobre a escolha de uma proteína fluorescente apropriado para a sua experiência ^9.

Seleção Promotor

A seleção de um promotor vai depender muito do seu tipo de célula ou fenótipo de interesse. Para os organismos tais como B. subtilis, alguns genes repórter específicos do tipo de célula ter sido estabelecida na literatura. Para outras cepas de bactérias, examinando microarray ou transcrição de dados será necessário fornecer informações sobre quais genes são altamente regulada de acordo com as condições em que o seu tipo de célula de interesse is manifestado. Um estudo recente catalogado a transcrição de B. subtilis sob 104 diferentes condições de crescimento, utilizando microarrays azulejos ^10. Este documento fornece informações abrangentes sobre quais genes são altamente regulada em diferentes condições, o que é de valor inestimável para os fenótipos menos bem caracterizados.

Ao invés de mapear regiões promotoras específicas para cada gene de interesse, que normalmente simplesmente utilizar a sequência de 200-500 pb a montante do gene como promotor. O comprimento exacto sequência depende do contexto genómico: regiões mais curtas são utilizados quando necessário para evitar a inclusão de regiões codificantes a montante da vizinha grelhas de leitura abertas.

Loci e integração Neutro

Como manter a construção repórter na sua estirpe bacteriana torna-se a última pergunta na concepção de uma fluorescente tensão transcricional repórter. Em bactérias, os genes de interesse são frequentemente mantidosem plasmídeos utilizando selecção de antibiótico. No entanto, pode não ser possível a utilização de antibióticos durante a co-cultura sem matar os microrganismos ambientais. Se os plasmídeos são mantidos estavelmente nas suas espécies bacterianas, pode ser possível aumentar suas bactérias contendo um plasmídeo repórter-borne, na presença de antibióticos para se preparar o repórter para o rastreio, e, em seguida, eliminar o uso de antibióticos durante o próprio co-cultura, na esperança de que o plasmídeo vai ser suficientemente mantidas para permitir a fluorescência. No entanto, se plasmídeos são facilmente perdidos em sua bactéria, ou são perdidos em condições de estresse, isso não vai ser uma opção viável. Em muitos casos, a melhor solução será integrar a construção repórter no cromossoma bacteriano, que permite a manutenção estável do repórter, mesmo na ausência de selecção. Para que a integração para não atrapalhar a expressão normal ou regulação de seu gene de interesse, recomendamos a integração em um site ectópica no cromossomo que can actuar como um "locus de ponto morto." Em B. subtilis estes locais de integração são genes que – quando mutado – transmitir um fenótipo em certos meios de comunicação mínima (permitindo que integrantes de ser identificado sem seleção antibiótico), mas não alteram o crescimento ou a produção de esporos em rich media, e incluem genes como Amye, Laca, thrC, pyrD, gltA, e Saca (transmitindo a capacidade de utilizar o amido, β-galactósidos, treonina, uracilo, glutamato, e de sacarose, respectivamente) ^11-13.

Embora a integração destes genes têm sido eficazmente utilizados durante muitos anos em B. subtilis (particularmente em Amye e Laca), conhecimento similar pode não estar disponível para genes em muitas outras espécies bacterianas. O uso de pontos de ligação de fagos são ótimas alternativas para os locais de integração cromossômicas neutros: muitas espécies específicas ^14-16, bem como sites gerais de integração, como local de ligação a Tn7 (att Tn7) têmforam identificados e utilizados para as inserções de genes em muitas espécies bacterianas ^17,18.

Micróbios ambientais

Nós usamos o solo como uma fonte direta de micróbios ambientais para nossa tela de co-cultura. O solo contém uma grande diversidade de microrganismos, e muitos desses organismos são fonte rica de produtos naturais. Utilizando suspensões líquidas de solo colocadas directamente em placas com a estirpe repórter fluorescente transcrição (sem isolamento prévio das bactérias do solo), é possível simplificar consideravelmente a abordagem experimental. O solo pode ser usado imediatamente após a colheita, ou congeladas a -80 ° C para uso futuro. O uso imediato tem a vantagem de uma maior diversidade de micróbios potencialmente podem ser cultivadas, incluindo aqueles que não irão sobreviver a congelação bem. Tem a desvantagem de que a concentração de organismos do solo cultivável a partir destas amostras é desconhecida, o aumento do número de placas de tela que tem de ser usado. Delayed utilização tem a vantagem de que os ufc / ml para cada fonte de solo pode ser determinada previamente, permitindo que um número optimizado de colónias a ser cultivado em cada placa de tela. No entanto, é necessário que os organismos do solo ser capaz de sobreviver congelamento.

Note-se que a diversificação da piscina indutor sendo examinado (ou seja, as fontes de solo) parece ser mais eficaz na identificação de novas interações entre espécies de triagem em profundidade sobre o mesmo solo: maior diversidade filogenética foi observada nos acessos identificados em nossa tela de matriz de indução como fontes adicionais de solo foram examinados em vez de triagem das mesmas fontes de solo mais profundamente (EA Shank e R. Kolter, Harvard Medical School, resultados não publicados).

Visão global

A abordagem que descrevemos aqui é simples em termos de seus requisitos técnicos. Trata-se: 1) a construção de uma transcrição repórter fluorescente em B. subtilis ou umaoutras espécies de bactérias de interesse, 2) identificar as condições em que este repórter não está activado, 3) a preparação de aliquotas desta estirpe repórter e os organismos a serem rastreadas (no nosso caso o solo, mas outras fontes podem ser utilizadas em vez disso), 4) misturando estes dois conjuntos de micróbios em meios sólidos, 5) identificar e isolar putativo induzindo organismos, e 6), confirmando que estes organismos, de fato ativar este fenótipo em uma tela secundária. Uma vez identificados, estes organismos e seus metabolitos nos fornecem ferramentas químicas para modular o comportamento de bactérias, para estudar a fisiologia bacteriana e interacções microbianas, e para actuar potencialmente como novos suportes para compostos terapêuticos futuras.

Protocol

1. Selecione um gene repórter e construir um repórter fluorescente Transcriptional Para B. subtilis: Veja o artigo Jove em referência 19 para um protocolo que descreve a construção de repórteres transcricionais fluorescentes em Bacillus subtilis. Por outras espécies bacterianas: Identificar um gene que é regulada positivamente durante a resposta fisiológica de interesse. Isto pode basear…

Representative Results

Esta tela foi utilizado para identificar organismos do solo que segregam uma substância que altera a fisiologia do B. subtilis. Os resultados descritos aqui focar o tipo de células produtoras de matriz de B. subtilis, que produz a proteína e exopolissacarídeo que são necessários para a formação de biofilme robusta nesta bactéria. Nós selecionamos o promotor do operon Tapa-sipW-tasa para nossa construção repórter fluorescente (P tapa-YFP). Este operão codifica …

Discussion

Uma das limitações inerentes a este protocolo é que ele conta com o cultivabilidade de organismos microbianos. Como tem sido bem documentada ^24, mais a vida microbiana no planeta não pode (ainda) ser cultivadas sob as condições de cultura exploradas até o momento. Assim, um grande número de interações entre espécies microbianas que estão ocorrendo em ambientes naturais vai passar despercebido usando essa abordagem. No entanto, uma vez que o nosso desejo é o de identificar não só a existência d…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Spectrophotometer			Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.
Luria broth, Lennox	VWR	80017-484	Alternative media sources may be necessary.
Glass beads, 3 mm	VWR	26396-508
Gel loading tips, round	VWR	29442-666
Glass rods	VWR	59060-069
Fluorescence dissecting stereoscope	Zeiss	N/A	The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.