Methoden zur Analyse und Modulation von NF-kappaB-abhängigen adulte Neurogenese
Summary
Methoden zur Manipulation und Analyse von NF-kB-abhängige erwachsene Neurogenese beschrieben. Ein detailliertes Protokoll für eine Gyrus dentatus abhängige Verhaltenstest (als das räumliche Muster trenn Barnes Labyrinth) zur Untersuchung der kognitiven Ergebnis in Mäusen dargestellt. Diese Technik sollte auch dazu beitragen, dass Untersuchungen in anderen experimentellen Einstellungen.
Abstract
Der Hippocampus spielt eine zentrale Rolle bei der Bildung und Konsolidierung des episodischen Erinnerungen und der räumlichen Orientierung. Historisch ist der Hippocampus als sehr statisch anatomischen Bereich des Gehirns von Säugetieren angesehen. Allerdings haben die jüngsten Ergebnisse zeigten, dass der Gyrus dentatus des Hippocampus ist ein Bereich von enormer Plastizität bei Erwachsenen, die nicht nur Änderungen der bestehenden neuronalen Schaltkreisen, sondern auch adulte Neurogenese. Diese Plastizität ist von komplexen Transkriptionsnetz reguliert, wobei der Transkriptionsfaktor NF-&kgr; B spielt eine herausragende Rolle. Um zu untersuchen und zu manipulieren, adulte Neurogenese, ein transgenes Mausmodell für Vorderhirn-spezifische neuronale Hemmung von NF-kappaB-Aktivität verwendet werden.
In dieser Studie werden Verfahren zur Analyse von NF-&kgr; B-abhängigen Neurogenese, einschließlich der strukturellen Aspekte, die neuronale Apoptose und Proliferation Vorläufer und kognitive Bedeutung whic beschriebenh wurde speziell über eine Gyrus dentatus (DG)-abhängigen Verhaltenstest, das räumliche Muster Trennung Barnes-Labyrinth (SPS-BM) bewertet. Die SPS-BM-Protokoll könnte einfach für die Verwendung mit anderen transgenen Tiermodellen, den Einfluss bestimmter Gene auf erwachsene Neurogenese beurteilen angepasst werden. Ferner könnte SPS-BM in anderen experimentellen Einstellungen auf die Untersuchung und Manipulation DG abhängigen Lern, beispielsweise mit pharmakologischen Mitteln gerichtet werden.
Introduction
Ontologisch ist der Hippocampus eine der ältesten bekannten anatomischen Hirnstrukturen. Es ist für verschiedene komplexe Aufgaben, wie z. B. Schwenk Funktionen bei der Regulation des Langzeitgedächtnisses, die räumliche Orientierung und die Bildung und Verfestigung des jeweiligen Speicher. Anatomisch, der Hippocampus besteht aus Pyramidenzellschichten (Stratum pyramidale), einschließlich der Ammonshorn (CA1, CA2, CA3 und CA4) Regionen und Gyrus dentatus (Gyrus dentatus), die Körnerzellen und neuronalen Vorläuferzellen ein paar in seinem Subgranularzone enthält . Die Körnerzellen ragen in Richtung der CA3-Region über den so genannten Moosfasern (Axone der Körnerzellen).
Bis zum Ende des letzten Jahrhunderts wurde die erwachsenen Gehirn von Säugetieren angenommen, dass ein statisches Organ fehlt zellulären Plastizität und Neurogenese sein. Doch in den letzten zwei Jahrzehnten eine wachsende Anzahl von Beweisen zeigt deutlich, adulte Neurogenese, die sich in mindestenszwei Gehirnregionen, die Subventrikularzone (SVZ) und der Subgranularzone des Hippocampus.
Unsere früheren Untersuchungen, und die der anderen Gruppen haben gezeigt, dass der Transkriptionsfaktor NF-&kgr; B ist eine der wichtigsten Regulatoren des Molekularneurogenese und daß seine Deregulierung führt zu schweren strukturellen Mängel hippocampalen und kognitiven Beeinträchtigungen 1-6. NF-&kgr; B ist der generische Name eines induzierbaren Transkriptionsfaktor verschiedener dimerer Kombinationen von fünf DNA-bindenden Untereinheiten zusammengesetzt: p50, p52, c-Rel, RelB und p65 (RelA), letztere drei davon mit Transaktivierungsdomänen. Im Gehirn ist die häufigste Form im Zytoplasma ein Heterodimer von p50 und p65, die in einer inaktiven Form von Inhibitor-kappa-B (IkB)-Proteine gehalten wird.
Um zu studieren und direkt manipulieren NF-kB-driven Neurogenese, verwenden wir transgene Mausmodelle, um einfache Hemmung der alle der NF-kB subun ermöglichenseine, insbesondere im Vorderhirn 7 (siehe Fig. 1). Zu diesem Zweck haben wir rassige überqueren die folgenden transgenen Mauslinien, IKB / – und -/tTA. Die transgene IKB / – Linie wurde mit einem trans-dominant negative Mutante von NF-kB-Hemmer IκBa (Super-Repressor-IκBa-AA1) erzeugt 8. Im Gegensatz zu den Wildtyp-I &kgr; B, hat I &kgr; B-AA1 zwei Serin-Reste zu Alaninen (V32 und V36), das die Phosphorylierung und anschließenden proteasomalen Abbau des Inhibitors behindern mutiert. Für Vorderhirn Neuronen-spezifische Expression des IκBa-AA1-Transgen, IKB / – Mäuse mit Mäusen beherbergen eine Kalzium-Calmodulin-abhängige Kinase II &agr; gekreuzt (CAMKIIα)-Promotor, der durch Tetracyclin trans-Aktivator (tTA) angesteuert werden können 9.
p65-Knock-out-Mäuse haben einen embryonalen letalen Phänotyp, wegen der massiven Leber Apoptose 10, so dass die hier gezeigten Ansatz bietet eine elegante Methodefür die Untersuchung der Rolle von NF-kB in der postnatalen und adulten Neurogenese.
Die klassische Verhaltenstest, um räumliche Lern-und Gedächtnis Studie wurde in den 1980er Jahren von Richard Morris, einem Test, wie der Morris-Wasserlabyrinth (MWM) 11 bekannt beschrieben. In diesem offenen Bereich Wasser-Labyrinth, Tiere lernen, von undurchsichtigen Wasser auf einer versteckten Plattform auf Basis von Orientierung und Extra-Labyrinth Hinweise zu entkommen. Eine trockene Variante MWM ist die sogenannte Barnes Labyrinth (BM) 12. Dieser Test nutzt eine kreisförmige Platte mit 20 an der Grenze einer Platte angeordneten kreisrunde Löcher, mit einem Loch definiert als Flucht-Box, und visuelle Extra-Labyrinth Hinweise zur Orientierung. Beide experimentellen Paradigmen beruhen auf der Flugverhalten von einem Nagetier `s Abneigung gegen Wasser, oder offen, hell beleuchteten Räumen induziert. Beide Tests erlauben eine Untersuchung der räumlichen Orientierung, und die damit verbundene Gedächtnisleistung. Obwohl der Hippocampus spielt eine allgemeine und wesentliche Rolle in der räumlichen Gedächtnisbildung, die Hippocampus-regionen beteiligt unterscheiden sich je nach Test angewendet. Der Speicher BM getestet entsteht aus neuronalen Aktivität zwischen enthorinal Cortex (EC) und der Pyramidenzellen in der CA1-Region des Hippocampus angeordnet, ohne einen Beitrag der GD 13-16. Insbesondere die klassischen BM stützt sich hauptsächlich auf die Navigation über die monosynaptischen temporo-Ammonium-Weg von EG III der CA1 EG V. Wichtig ist, dass die DG entscheidend an der sogenannten räumlichen Mustererkennung 17, die nicht nur die Verarbeitung impliziert beteiligt visuelle und räumliche Informationen, sondern auch die Umwandlung von ähnlichen Vorstellungen oder Erinnerungen in unterschiedlichen, nicht überlappenden Darstellungen. Diese Aufgabe erfordert eine funktionale Tri-Synapsenschaltung von EC II DG CA3 zu CA1-und EC-VI, die nicht in der BM 15 getestet werden können.
Um diese Herausforderungen anzugehen, haben wir SPS-BM als Verhaltenstest entwickelt, um speziell zu testen Gyrus dentatus abhängige kognitive Leistung in Zusammenarbeitntrol Tiere, und in der IKB / tTA Super-Repressor-Modell folgende NF-KB-Hemmung. Wichtig ist, dass im Gegensatz zu der MWM oder der BM, die SPS-BM können subtile Verhaltensdefizite aus Wertminderungen der Neurogenese resultierenden offenbaren. Seit räumlich-Muster-Trennung ist strikt von einer Funktionsschaltung zwischen der EG und DG II und CA3 und CA1-und EC-VI, dieser Test ist sehr empfindlich auf mögliche Veränderungen in der Neurogenese, Modifikationen der Moosfaser-Weg oder Veränderungen der Gewebe-Homöostase innerhalb der DG.
Technisch gesehen ist der Aufbau der Test auf die Studie von Clelland et al., Wobei die räumliche Trennung Muster wurde unter Verwendung eines Holz 8-Arm-Radiallabyrinth (RAM) 19 geprüft. In unserer modifizierten Set-up wurden die acht Arme von sieben identische gelbe Lebensmittelhäuser ersetzt. Zusammenfassend hier gezeigten Methoden, einschließlich der Analyse der Double-exprimierenden (DCX +) Zellen im Hippocampus, die Moosfaser-Projektionen, neuronale Zell death und insbesondere die SPS-BM hier vorgestellten, können die Untersuchungen auf andere Modelle mit Transgene Maus, die einen Einfluss auf die adulte Neurogenese haben, angewendet werden. Weitere Anwendungen können die Studie von pharmakologischen Mitteln und die Messung ihrer Auswirkungen auf DG und räumliche Muster Trennung gehören.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adulten Neurogenese und die Möglichkeit ihrer Manipulation über die Hemmung von NF-kappaB in Neuronen und ihre spätere Reaktivierung über Doxycyclin, bietet eine faszinierende System für Untersuchungen neugeborenen Nervenzellen im erwachsenen Gehirn, als auch in neuronalen De-und Re-Generation . Der Vorteil bei diesem System ist, dass NF-&kgr; B-Signalwegs in Neuronen, Hemmung führt nicht nur zu Veränderungen in der neuronalen Zelltod Vorläufer Proliferation und Migration und schweren strukturellen und anato…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Angela Kralemann-Köhler für hervorragende technische Unterstützung. Hier beschriebenen experimentellen Arbeiten wurde in unserem Labor durchgeführt und wurde durch Zuschüsse der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG), um CK und BK und einem Zuschuss des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF) an BK unterstützt.
Materials
| Moria MC17 Perforated Spoon | FST | 10370-18 | removal of the brains |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi SV8 | removal of the brains |
| Surgical scissors | FST | 14084-08 | removal of the brains |
| Surgical scissors | FST | 14381-43 | removal of the brains |
| Dumont #5 forceps | FST | 11254-20 | removal of the brains |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | slides for immunohistochemistry |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | fixative |
| TissueTek OCT compound | Sakura Finetek | 1004200018 | embedding of the brains |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunolabs | 005-000-001 | blocking in IHC |
| Normal Rabbit Serum | Jackson Immunolabs | 011-000-001 | blocking in IHC |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immunolabs | 017-000-001 | blocking in IHC |
| anti-Neurofilament-M antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 2H3 | IHC, Dilution 1:200 |
| anti-doublecortin antibody | sc-8066 | Santa Cruz | IHC, Dilution 1:800 |
| anti-GFP antibody | ab290 | abcam | IHC, Dilution 1:2000 |
| anti-BrdU antibody | OBT0030G | Accurate Chemicals | IHC, Dilution 1:2000 |
| Fluoro Jade-C | FJ-C | HistoChem | Determination of neuronal cell death |
| Betadine | MUNDIPHARMA | D08AG02 | disinfectant |
| cryomicrotome | Leica | CM1900 | preparation of brain slices |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | perfusion |
| circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm) | lab made | none | plate for SPS-BM, diameter 120cm |
| Buraton rapid disinfectant | Schülke & Mayr | 113 911 | disinfectant |
| video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2 | tse systems | 302050-SW-KIT | tracking and analysis of SPS-BM |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | permeabilisation/IHC |
| cryotome | Reichert Jung/Leica | Frigomobil 1206 | preparation of 40µm brain slices |
| Mowiol 4-88 | Carl Roth | Art.-Nr. 0713 | embedding of the slides |
| SYTOX green | Invitrogen | S7020 | Nuclear staining |
| Food pellets (Kellog`s Froot Loops) | Kellog`s | SPS-BM | |
| Prism, Version 3.0 | Graph Pad Software, San Diego, USA | Statistical evaluation of SPS-BM | |
| Zen 2008 or Zen 2011 Software | Carl Zeiss | Software (Confocal microscope) | |
| D.P.X | Sigma-Aldrich | 317616 | mounting medium for Fluoro Jade C staining |
References
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