성인 쥐의 뇌의 기존 및 비 인습적 인 지역에서 신경 줄기 세포 성장

Summary

성인의 뇌에서 수확 한 신경 줄기 세포는 신경 시스템 개발의 기초 연구에서 재생 의학의 잠재적 인 임상 응용 프로그램을 탐험에 이르기까지 다양한 애플리케이션에 활용 증가하고있다. 이 실험 결과를 소리를하는 것이 중요합니다 이러한 세포를 성장하는 데 사용되는 분리 및 배양 조건에서 엄격한 통제를한다.

Abstract

최근 연구는 중추 신경계 (CNS) 재생 및 종양 줄기 세포의 인구 (SC에) 성인 뇌 내 거주자를 포함 것을 보여줍니다. 그러나 메커니즘이 정상적으로 정지 세포가 적절한 신경망의 기능뿐만 아니라, 신경 퇴행성 프로세스의 부상 및 완화 회복에 자신의 역할을 보장하기 위해 고용은 조금 이해된다. 이러한 세포는 혈관 및 면역 조절 성 시스템 모두로부터 신호들을 포함한 서스테인 환경을 제공 「틈새」이라고도 영역에 상주. 알 수없는 요인을 제외 정의 배양 조건에서 CNS의 SC와의 분리, 유지 보수 및 차별화, 따라서 자신의 생체 내 행동에 대한 통찰력을 제공하고, 약물 또는 유전자에 의한 치료에 액세스 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 성인 뇌의 특정 영역에서 CNS의 SC와의 문화를 생성하는 방법에 대한 자세한 정보를 제공하고 자신의 개발을 평가하는 접근신경 세포, 성상 세포, 그리고 체외에서 희소 돌기 아교 세포에 ifferentiation 가능성. 이 기술은 개별 SC에 자신의 자손을 연구하기 위해 시각화 할 수있는 단일 층 문화로 균일 한 세포 인구를 산출한다. 게다가, 다른 동물 모델 시스템과 임상 샘플을 가로 질러인가 될 수 손상된 성인 신경계 재생 반응을 예측하기 이전에 사용된다.

Introduction

한 세기 이상 전에 라몬 Y.를 Cajal에 의해 뇌 cytoarchitecture의 기본 관찰에 의해 규정 신경 생물학의 중심 교리는, 사춘기가 CNS ^1에서 발견되는 신경 네트워크의 복잡성을 주어진 후 신경이 어려울 것을 가졌다. 1960 년대에 알트만의 작품, 그리고 나중에 카플란, ³ H-티미 딘이 실제로 뉴런은 성인 뇌의 서로 다른 영역에서 생성되고 있었다 나타내는 성숙한 신경 세포에서 발견 될 수 있다는 것을 입증에도 불구하고, 교리는 ^{2, 3을} 유지하는 것을 계속했다. 증거는 가수 두뇌 ^4에 존재하는 뉴런의 수의 계절적 변화를 설명 Nottebohm의 연구를 탑재하는 것을 계속했다. 그것은 1999 년까지되지 않았을 때 쥐의 연관 학습 과제의 성능뿐만 아니라 Kornack 및 Rakic ​​시연의 관측과 해마 증가 뉴런의 생성에 굴드 등. 출판 일딸랑 딸랑 소리는 덜 엄격한, 더 플라스틱 뇌의 개념이, ⁵ 인식 된 성인 짧은 꼬리 ^{원숭이, 6에} 신경을 계속했다.

이 새로이 생성 된 신경 세포의 세포 소스에 대한 검색은 ⁷ 벽감으로 불리는 뇌의 영역에있는 줄기 ....

Protocol

이 작품은 Helsinski의 선언과 ARVO 동물 정책을 준수합니다. 드레스덴 대학의 동물 시설의 지침에 따라 동물 조직 수집에 사용 된 모든 관련 방법은 미행했다. 동물은 취급 및 보관 실험 동물의 사용 및 관리에 대한 독일 연방 지침에 따라, 그리고 연구는 Landesdirektion 드레스덴에 의해 승인되었습니다했다. 적절한 안락사 방법에 대한 교육 기관의 동물 정책 (IACUC 또는 다른 보드)에 문의하십시오.

특정 주식 및 시약의 작업 농도는이 프로토콜에 수반되는 시약 테이블에서 찾을 수 있습니다.

1. 배양 접시 준비

1. 75 μg의 충분한 볼륨 코트 요리 / ㎖ 폴리-L-오르니 틴 (즉, 2 ㎖ / 잘 6 잘 플레이트의) 하룻밤 2 일전 예약 해부 현재까지 세포 배양 인큐베이터에서.
2. 기음 폴리-L-오르니 틴 다음날 5 분 동안 PBS 3 ㎖와 잘 배 각각 세척.
3. 최종 세척을 제거한 다음 판에 피브로넥틴 (희석 1:250, PBS에 4 ㎍ / ml)에 추가하고 하룻밤 인큐베이터에서 접시를 놓습니다.
4. 해부의 날에 피브로넥틴을 기음과 요리를 PBS로 2 배 씻는다. 여전히 해리 조직 배양을위한 ....

Results

신경 줄기 세포를 수확되는 관심 영역을 확인하는 것은 중요한 첫 단계이며 그것은 세포의 합류 판을 얻​​는 데 걸리는 시간의 양을 정의 할 것이다. 예를 들어, SVZ는 고전 신경성 영역이며, 따라서 신경 줄기 세포의 상대적으로 높은 비율을 갖는다. 그러나, 여기에 제시된 기술은 종종 성인기 강력한 신경성 잠재력을 갖는 것으로 인식되지 않는 다른 영역으로 사용될 수있다. 이 프로토콜의 목적을 위해, 우리는 전방 접합면 (전방 부분)을 사용했다. 세포와 파편의 일부가 도금에 침전되지만, 매체는 일반적으로 다음의 본 저작이다 세포 물질의 양의 결과로 백탁 남아있을 것이다. 24 시간의 첫 번째 매체 변경이의 대부분을 제거합니다. 광학 현미경에 의해 시각 같이, 심지어 제 1 매질 변경 후에, 혈관과 함께, 남아있는 세포 물질의 다량있을 나타난다. 의 과정을 통해다음 몇 일, 별개의 증식 세포 인구의 식민지 현미경 (그림 2A)에서 표시 될 것입니다. 이들의 bFGF, ANG2, Dll4 및 JAK 억.......

Discussion

성공적으로 분리, 확장, 성인의 뇌에서 신경 줄기 세포의 분화에 중요한 단계의 대부분은 표준 조직 배양 기술에 공통으로 공유됩니다. 명심하는 목적은 성인의 뇌에서 분리 NSCs의 가능한 자신의 생체 내 특성 (그림 2,1)만큼을 유지해야한다는 것입니다. 종종 필요한주의와 적절한 속도 사이에 균형을 공격해야합니다. 두개골에서 뇌의 분리와 관심은 관심 영역의 식별이 훨씬 쉬워집니다. 동물 euthanization 다음 가능한 한 빨리 조직을 제거하고, 수확 및 세탁시 뇌 감기를 유지하는 것은 그것을 유지 더 엄격한과 크게 곰팡이를 구획 스테인리스 스틸에 배치 될 때 조직의 처리에 도움이됩니다. 이것은 또한 단면 처리 과정 동안 조직의 추출을위한 잠재력을 최소화한다. 프로토콜은 ABL 인의 혜택그들은 시험관에 배치되면이 세포 생존을 증가로 전자, 신속하게 도금의 지점에 세포를 얻을 수 있습니다. 이전 절편에 적절한 조직 세척 또한 문화에 오염의 가능성을 줄일 수 있습니다.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-웰 조직 배양 접시	BD Biosciences	353934
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P-3655	5 mg/ml 스톡 용액 이중 증류수에서 제조(-20°C에서 몇 달 동안 안정; C) .< / p > < p > 물 중 작업 농도 0.5 mg / ml (4 °에서 1 개월 동안 안정; C).
피브로넥틴	R& D Systems	1030-Fn	원액을 교반하지 마십시오
여과 장치	Corning Life Sciences	430769
DMEM/F-12	Mediatech	10-090-CV	완전한 N2 매체 준비는 아래 참고 사항을 참조하십시오
Apo-transferrin	Sigma-Aldrich	T-2036
Insulin	Sigma-Aldrich	I-0516
Putrescine	Sigma-Aldrich	P-5780	1 M 재고 용액 ddH2O (20°C에서 안정; C 6 개월 동안)
나트륨 셀레 나이트	시그마 - 알드리치	S-5261	500 &마이크로; ddH2O의 M 원액(-20에서 안정 > C 6 개월 동안)
프로게스테론	시그마 - 알드리치	P-8783	100 &마이크로; 에탄올의 M 원액 (-20°C에서 안정; C 6개월)
페니실린/스트렙토마이신	인비트로겐	15140-122
인산염 완충 식염수	Mediatech	21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	R& D Systems	233-FB	작업 농도 20 ng/ml
델타4 (Dll4)	R& D Systems	1389-D4	작업 농도  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)	R& D Systems	623-AN	작동 농도  500 ng/ml
JAK 억제제	Calbiochem	420099	작동 농도 200 nM
소 혈청 알부민	Sigma-Aldrich	A-2058
15 및 50 ml 원뿔형 튜브	Corning Life Sciences	430053, 430829
기타 필요한 품목은 다음과 같습니다 : 면도날 및 집게를 포함한 일반 해부 도구, 성인 쥐 (3-6 개월; Sprague-Dawley 또는 Long Evans), CO2 중독 챔버, 세포 배양 및 인큐베이터용 층류 후드 인큐베이터(가습, 37 ° C, 5% CO2, 5% O2). 참고: 완전한 N2 배지 준비를 위해 DMEM/F-12(500ml) 한 병에 아포트랜스페린 0.05g, 인슐린 0.0125g(10mM NaOH 1ml에 갓 사전 용해), 50μ를 추가합니다. Putrescine의 l, 30 μ 나트륨 셀레 나이트의 l, 100 μ 프로게스테론 스톡의 l, 그리고 페니실린/스트렙토마이신 용액 5ml.  필요한 경우 pH를 7.2로 조정합니다. 필터 살균 및 4°C에서 보관; C는 최대 3 주 동안 빛으로부터 보호 합니다.
면역형광 시약 표
파라포름알데히드	전자 현미경 과학	15719
일반 당나귀 혈청(NDS)	시그마-알드리치	D-9663
트리톤 X-100	시그마-알드리치	T-8787
4,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)	시그마-알드리치	D-8417	5 mg/ml 재고 메탄올
1차 항체 테이블
Nestin	Chemicon	MAB353	희석 계수: 1:400 종: 마우스 IgG1
Hes3	Santa Cruz	sc-25393	희석 계수: 1:100 종: 토끼 IgG
Sox2	R& D Systems	MAB2018	희석 계수: 1:100 종: 마우스 IgG2a
CNPase	Chemicon	MAB326	희석 계수: 1:200 종: 마우스 IgG1
β-tubulin III (TUJ1)	R& D Systems	MAB1195	희석 계수: 1:500 종: 마우스 IgG2a
신경교섬유산성 단백질(GFAP)	Dako North America	Z0334	희석 인자 1:500 종: 토끼
2차 항체 표
Alexa    568	Invitrogen	A-21124	희석 인자: 1:200 종: 염소 항 마우스 IgG1
Alexa 488	Invitrogen	A-21131	희석 인자: 1:200 종: 염소 항 마우스 IgG2a
Cy5	Jackson ImmunoResearch	59883	희석 계수: 1:200 종: 염소 안티 토끼