Valutazione del calcio Sparks in intatte fibre muscolari scheletriche

Summary

Qui descritto è un metodo per misurare direttamente scintille di calcio, le unità elementari di Ca ^{2 +} liberano dal reticolo sarcoplasmatico in fibre muscolari scheletriche intatte. Questo metodo utilizza osmotico stress-mediata attivazione di Ca ^{2 +} liberazione dal recettore della rianodina nelle fibre muscolari isolate. La dinamica e la capacità omeostatica di intracellulare di Ca ^{2 +} segnalazione possono essere utilizzati per valutare la funzione muscolare in salute e malattia.

Abstract

Il mantenimento omeostatico Ca ^{2 +} segnalazione è un processo fisiologico fondamentale nelle cellule viventi. Ca ^{2 +} scintille sono le unità elementari di Ca ^{2 +} Segnalazione di fibre muscolari striate che appaiono come altamente localizzata Ca ^{2 +} eventi di rilascio mediati dal recettore della rianodina (RyR) Ca ^{2 +} rilascio canali sul reticolo sarcoplasmatico (SR) membrana. Corretta valutazione del muscolo Ca ^{2 +} scintille potrebbero fornire informazioni sulle intracellulari di Ca ^{2 +} proprietà manipolazione dei muscoli striati sani e malati. Sebbene Ca ^{2 +} scintille eventi sono comunemente visto in cardiomiociti riposo, sono raramente osservati in riposo fibre muscolari scheletriche, quindi vi è la necessità di metodi per generare e analizzare scintille nelle fibre muscolari scheletriche.

Dettagliate ecco un protocollo sperimentale per la misurazione Ca ^{2 +} scintille in digitorm brevis (FDB) fibre muscolari isolate flessori con fluorescent Ca ^{2 +} indictors e la microscopia confocale a scansione laser. In questo approccio, fibre FDB isolati sono esposti a stress ipoosmotico transitorio seguito da un ritorno di soluzione fisiologica isotonica. In queste condizioni, un robusto Ca ^{2 +} scintille risposta viene rilevato adiacente alla membrana sarcolemmal in giovani fibre muscolari sani FDB. Alterato Ca ^{2 +} scintille risposta viene rilevato in fibre muscolari scheletriche distrofici o invecchiate. Questo approccio ha recentemente dimostrato che la segnalazione membrana delimitato coinvolge cross-talk tra inositolo (1,4,5)-recettore trifosfato (IP ₃ R) e RyR contribuisce a Ca ^{2 +} attivazione scintilla nel muscolo scheletrico. In sintesi, i nostri studi con stress osmotico indotto Ca ^{2 +} scintille hanno dimostrato che questa risposta intracellulare riflette un muscolo meccanismo di segnalazione in fisiologia e l'invecchiamento / stati di malattia, compresi i modelli murini di distrofia muscolare (topi mdx) o la sclerosi laterale amiotrofica (ALS modello).

Introduction

Libero intracellulare Ca ^{2 +} ([Ca ^{2 +]} _i) è un messaggero secondario versatile e importante che regola molteplici funzioni cellulari nelle cellule eccitabili come i neuroni, cardiaco, scheletrico e muscoli lisci (per recensione vedi Stutzmann e Mattson ^1). Regolamentata Ca ^{2 +} mobilitazione e di cross-talk tra reticolo sarcoplasmatico (SR) e T-tubulo (TT) membrane sono regolatori fondamentali della fisiologia muscolare. Inoltre, variazioni di Ca ^{2 +} segnalazione avevano dimostrato di essere un meccanismo alla base della disfunzione contrattile in varie malattie muscolari.

Ca ^{2 +} scintille sono localizzati gli eventi Ca ^{2 +} rilascio elementari provenienti dall'apertura del recettore rianodina (RyR) del canale sul reticolo sarcoplasmatico (SR) membrana ^2. Nel muscolo cardiaco, scintille verificano spontaneamente attraverso l'apertura del canale RyR2 da un Ca ^{2 +-indotti} Ca ^{2 +} release (CICR) Meccanismo di ^3-5. Nel muscolo scheletrico, RyR1 è strettamente controllata dal sensore di tensione sulla membrana ^6,7 TT. Così Ca ^{2 +} scintille vengono soppressi e raramente rilevate in condizioni di riposo nelle fibre muscolari scheletriche intatte. Fino a poco tempo, la membrana sarcolemmal doveva essere disturbato da vari metodi chimici o meccanici "skin" per disaccoppiare la soppressione del sensore di tensione in RyR1 e ha permesso di Ca ^{2 +} innescare eventi per essere rilevati nel muscolo scheletrico ^8,9. Un metodo precedentemente descritto richiesto permeabilizzazione della membrana delle fibre muscolari dal detersivo saponina ^10.

Nel 2003, abbiamo scoperto che lo stress sia ipoosmotico transitori o stress iperosmotico potrebbero indurre periferico Ca ^{2 +} scintille adiacente alla membrana sarcolemmal nelle fibre muscolari intatte ^11. Questo metodo è stato poi modificato per studiare il meccanismo molecolare e modulazione di Ca ^{2 +} </sup> rilascio e la dinamica ^12-16. Qui delineare i dettagli del nostro approccio sperimentale per l'induzione, il rilevamento e l'analisi di Ca ^{2 +} scintille nel muscolo scheletrico intatto. Presentiamo anche il programma di analisi scintilla su misura che può essere utilizzato per quantificare le proprietà elementari dei singoli Ca ^{2 +} scintille nel muscolo scheletrico, ad esempio la frequenza di accensione e ampiezza (Δ F/F0, che riflette la probabilità di apertura dei canali RyR e il Ca ^{2 +} carico all'interno del SR); tempo al picco (tempo di salita) e durata (FDHM, piena durata ampiezza metà-massimale) di scintille, così come la distribuzione spaziale di Ca ^{2 +} scintille. Inoltre, vi presentiamo la prova che pubblicitari alterato Ca ^{2 +} scintille ai diversi stati fisiopatologici nel muscolo scheletrico, come la distrofia muscolare e la sclerosi laterale amiotrofica.

Il vantaggio di questa tecnica comporta la capacità di misurare Ca ^{2 +} in relativamente isolatori passanticellule invecchiate, invece di nudo le fibre muscolari, permettendo la registrazione di Ca ^{2 +} scintille nelle condizioni più vicina alla fisiologica. Inoltre, il programma progettati su misura fornisce un calcolo più accurato delle proprietà della scintilla in relazione alle fibre muscolari.

Protocol

1. Impostazione osmotica stress sistema di perfusione La figura 1 è un protocollo schematica di calcio scintille valutazione in fibre muscolari scheletriche intatte. Impostare un tre assi (xyz) micromanipolatore grado di posizionare l'estremità di uscita del sistema di perfusione contenente almeno due canali. Questo potrebbe essere fatto con barilotto monouso Luer-siringa con divisoria tre – vie Luer – Lok rubinetto per accendere e / o speg…

Representative Results

Studi precedenti hanno mostrato che lo stress ipoosmotico transitori indotti periferico Ca 2 + scintille adiacente alla membrana sarcolemmal nelle fibre muscolari intatte 11. Figura 1 mostra le immagini delle fibre muscolari intatte singole con membrana sarcolemmal liscia e caratteristiche striature chiare. Figura 2 è tipica Ca 2 + scintille (come immagini XY) sono stati indotti da (100 sec) trattamento transitorio con una soluzione ipoosmotico…

Discussion

Questo metodo di valutazione Ca ^{2 +} scintille nel muscolo scheletrico intatto è un utile strumento per la fisiologia muscolare e ricerca di malattia. Abbiamo dimostrato che la risposta Ca ^{2 +} scintilla è stato alterato in condizioni diverse, comprese distrofia muscolare ^11, invecchiamento ^{18, _19,} così come nella sclerosi laterale amiotrofica ^20. Il nostro recente studio ha anche rivelato l'accoppiamento funzionale tra IP ₃ recettore e Ry…

Materials

Dissecting microscope			Dissect out fibers and check muscle integrity
Dissection tools -scissors, and fine tip forceps	Fine Science Tools
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	DOW CORNING	184 SIL ELAST KIT	Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60-mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become clear, colorless solid substrate.
60-mm glass petri dish	Pyrex	3160	Fiber dissection
Isotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Minimal Ca2+ Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
Hypotonic Tyrode Solution	Sigma-Aldrich
collagenase type I	Sigma-Aldrich	C-5138	Fiber digestion
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201	Fluorescent Ca2+ imaging dyes
TMRE	Invitrogen	T669	mitochondrial membrane potential fluorescent dyes
Delta TPG dishes	Bioptechs	0420041500C	35 mm glass bottom dish for imaging
Spark Fit software			data analysis software
Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope	Bio-Rad
3 axis micromanipulator	Narishige International	MHW-3
temperature controllable orbital shaker	New Brunswick scientific		Fiber dissociation