Cedo metamórfica de Inclusão Tecnologia para o Comportamento de Monitoramento de insetos de vôo
Summary
We present a novel surgical procedure to implant electrodes in Manduca sexta during its early metamorphic stages. This technique allows mechanically stable and electrically reliable coupling with the neuromuscular tissue to study flight neurophysiology dynamics. We also present a novel magnetic levitation platform for tethered studies of insect yaw.
Abstract
Early Metamorphosis Insertion Technology (EMIT) is a novel methodology for integrating microfabricated neuromuscular recording and actuation platforms on insects during their metamorphic development. Here, the implants are fused within the structure and function of the neuromuscular system as a result of metamorphic tissue remaking. The implants emerge with the insect where the development of tissue around the electronics during pupal development results in a bioelectrically and biomechanically enhanced tissue interface. This relatively more reliable and stable interface would be beneficial for many researchers exploring the neural basis of the insect locomotion with alleviated traumatic effects caused during adult stage insertions. In this article, we implant our electrodes into the indirect flight muscles of Manduca sexta. Located in the dorsal-thorax, these main flight powering dorsoventral and dorsolongitudinal muscles actuate the wings and supply the mechanical power for up and down strokes. Relative contraction of these two muscle groups has been under investigation to explore how the yaw maneuver is neurophysiologically coordinated. To characterize the flight dynamics, insects are often tethered with wires and their flight is recorded with digital cameras. We also developed a novel way to tether Manduca sexta on a magnetically levitating frame where the insect is connected to a commercially available wireless neural amplifier. This set up can be used to limit the degree of freedom to yawing “only” while transmitting the related electromyography signals from dorsoventral and dorsolongitudinal muscle groups.
Introduction
Inserção de eletrodos, mesmo com sistemas eletrônicos ligados aos insetos para aplicações de gravação de telemetria, tem sido um importante método para compreender como os sistemas neurais função durante o vôo naturais 1. Colocar ou implantar sistemas artificiais em insetos tem colocado muitos desafios que envolvem o potencial de perturbar o vôo natural do inseto. Apego superficial ou inserção cirúrgica de plataformas artificiais sobre o inseto adulto não é confiável devido à possibilidade de deslocamento dos dispositivos inseridos causados pela inércia e de estresse induzido por forças do corpo. Superficialmente anexado ou eletrodos inseridos cirurgicamente também são propensos a ser rejeitado pelos insetos como um corpo estranho. Além disso, a operação de implantação requer a remoção de escamas e pilhas em todo o exoesqueleto. A camada de cutícula espessa também precisa ser penetrado por inervações cirúrgicos que podem causar danos nos tecidos garantia, interferindo assim com o vôo natural do inseto. Todos os tstas fatores podem fazer uma operação de implante cirúrgico ou superficial uma tarefa desafiadora e delicado. A fim de aliviar estas preocupações envolvidas na fixação externamente sistemas de comando e sensores para os insetos, uma nova metodologia que envolve o crescimento metamórfico serão descritos neste artigo.
O desenvolvimento de insectos metamórfica holometabolic começa com a transformação da larva (ou ninfa) para um adulto com uma fase de pupa intermédia (Figura 1). O processo envolve um grande metamorfose reprogramação tecido incluindo degeneração seguido de remodelação. Esta transformação vira uma larva terrestre para um adulto inseto demonstrando vários comportamentos complexos 2,3.
A sobrevivência dos insetos após cirurgias parabiótico extremas tem sido demonstrado que as cirurgias foram realizadas durante os primeiros estágios metamórficos 4,5. Nestas cirurgias, as caus histogênese de desenvolvimentoferidas cirúrgicas ed para ser reparado em períodos mais curtos. Seguindo essas observações, uma nova técnica foi desenvolvida, onde a implantação de eletrodos eletricamente condutivo foi realizada durante os primeiros estágios de crescimento metamórfico (Figura 1). Isso permite que um anexo biomecanicamente seguro sobre o inseto 6. Uma interface altamente confiável também é presa com neural do inseto e os sistemas neuromusculares 7. Esta técnica é conhecida como "Early Metamorphosis Inclusão Tecnologia" (EMIT) 8.
Após a reconstrução do sistema de tecido inteiro, estruturas inseridas na pupa emergir com o inseto adulto. Grupos musculares aéreas perfazer a 65% da massa total do corpo torácica e, portanto, é um alvo relativamente conveniente para o procedimento de EMIT 9. Durante a batida de asa básica, as mudanças na morfologia do vôo ligando dorsolongitudinal (dl) e dorsoventral (dv) músculos com que a asa articulatgeometria íon para gerar sustentação 10. Por isso, a coordenação funcional dos músculos dl e dv tem sido um tema de pesquisa ativa em neurofisiologia vôo. Insetos amarrados em ambientes visuais programados eletronicamente tem sido o método mais comum para estudar a neurofisiologia de comportamentos locomotores complexos 11,12. Arenas cilíndricos compostos de emissores de luz de diodo painéis têm sido usados por esses ambientes de realidade virtual, onde os insetos voadores são amarrados no meio eo movimento é simulado, atualizando dinamicamente a exibição visual panorâmica envolvente. No caso dos insectos menores, tais como mosca da fruta Drosophila, amarrar é conseguido ligando um pino de metal para o tórax dorsal do insecto e colocar o pino sob um íman permanente 13,14. Este método só permite a quantificação das respostas motoras através de observações visuais com câmeras de alta velocidade, sem qualquer análise eletrofisiológica. Além disso, este metod tem sido ineficiente para suspender o corpo maior e mais pesado de Manduca sexta. Para resolver este problema, beneficiaram de quadros magneticamente levitando onde peso leve armações com ímãs ligados à sua parte inferior são levitado por meio de forças eletromagnéticas. Quando combinado com amplificadores neurais disponíveis comercialmente e matrizes de LED, este fornece uma plataforma para controlar a saída de vôo-motor e registrar a eletrofisiologia relacionado de Manduca sexta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Há vários passos críticos durante a inserção cirúrgica dos eletrodos de registro que afetam a capacidade de gravar dados nas etapas posteriores do protocolo. Os eletrodos de registro deve ser inserido na pupa um dia depois de expor pontos de asa para o lado dorsal. Se a inserção é feita de dois ou mais dias, após esse tempo, o tecido do insecto não terá tempo suficiente para se desenvolver em torno e estabilizar os eléctrodos inseridos. Isto poderia levar ao movimento dos eléctrodos implantados e gravaçõ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AB agradece a Fundação Nacional de Ciência para o financiamento no âmbito do programa de Cyber sistemas físicos (1239243) e da Divisão de Educação de Graduação (1245680); e da Agência de Defesa de Projetos de Pesquisa Avançada (DARPA) para apoiar as fases iniciais deste trabalho. As etapas anteriores deste trabalho foi realizado por AB no laboratório do Prof Amit Lal da Universidade de Cornell. AB graças Ayesa Sinha e Prof Lal para orientação experimental e geração de idéias nessa fase. Manduca sexta (Linnaeus 1763) foram obtidos a partir de uma colônia mantida pelo Departamento de Biologia da Universidade de Duke, Durham, NC, EUA. Traças foram utilizadas no prazo de 5 dias da eclosão. Gostaríamos de agradecer Triângulo Biosystems Internacional, especialmente David Juranas e Katy Millay para sua assistência técnica excelente e uso de seu sistema Neuroware. Também gostaria de agradecer a Will Caffey por sua ajuda durante os experimentos.
Materials
| Coated stainless steel wire | A-M Systems | 791900 | 0.008’’ bare, 0.011’’ coated, annealed |
| Flexible electrode wire | Litz or inductor wire can be used. | ||
| Surface-mount FFC connector | Hirose Connector | FH28E-20S-0.5SH(05) | |
| Tweezers | Grobet USA | N/A | Clean with 70% alcohol before use on the insect. |
| Kim-Wipes | Kimberly-Clark Worldwide | 34155 | Any size delicate-wipe tissues can be used. |
| Teflon tape | N/A | N/A | 5 mm width Teflon tape. |
| Hypodermic Needle | Becton Dickinson & Co. | 30511 | 20-30 gauge hypodermic needle can be used. Video showed 30 gauge. |
| Rigid Fixation Stick | N/A | N/A | Variety of materials can be used (e.g. coffee stirrers) |
| Insect Emergence Cage | N/A | N/A | Plastic pet cage lined with packing paper or similar padding. Ventilation holes are needed. |
| Thermal Cauterizer | Advanced Meditech International | CH-HI CT2103 (tip) | Optional equipment used for application of dental wax. |
| Dental Wax | Orthomechanics LC., Broken Arrow, Oklahoma | N/A | Optional material used for stabilizing the electrodes on the insect. |
| Magnetic Levitation Platform | N/A | N/A | Custom designed frame fabricated in-house with 3D prototyping |
| CA40 Instant Adhesive | 3M | 62-3803-0330-5 | Avoid skin contact. Use gloves when handling. |
| 70% Isopropyl alcohol | store brand | Commercially available from many suppliers. | |
| PCB Etchant | RadioShack | 276-1535 | Toxic if swallowed or ingested, skin irritant |
| EQUIPMENT: | |||
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| TBSI Neuroware Software | Triangle Biosystems International | N/A | NeuroWare v1.4. Software for importing .nex files obtained at Technologies, N. NeuroExplorer Code and Scripts. (2012).at http://www.neuroexplorer.com/code.html |
| TBSI Wireless Recording System | Triangle Biosystems International | W5 FI | USB Base station, headstage unit, charger |
| 16 Channel Amplifier A-C Amplifier | A-M Systems | 950000 | Model 3500 (110 V) |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | DSO1014A | Oscilloscope, 100 MHz, 4 channel |
| Microscope | N/A | N/A | 5x magnification microscope to assist visualization during electronics construction. |
| Ultrasonic Cleaner | ColeParmer | EW-08848-10 | Ultrasonic Cleaner with Timer, |
References
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