마우스 급성 뇌 조각의 Neuroblast 마이그레이션의 생체 내 출생 일렉트로 및 시간 경과 영상
Summary
Neuroblast 이주는 출생 후 신경에 근본적인 이벤트입니다. 우리는 급성 뇌 조각의 시간 경과 영상을 사용하여 생체 내 출생의 일렉트로 그들의 이주 이후의 시각화하여 neuroblasts를 효율적으로 표시하기위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 비디오 추적하여 neuroblast 역학의 정량 분석에 대한 설명을 포함한다.
Abstract
subventricular 영역 (SVZ)는 출생 후 뇌의 주요 신경 인성 틈새 시장 중 하나입니다. 여기에, 신경 전구 세포 증식과 후각 망울 (OB)으로 주동이의 철새 스트림 (RMS)을 따라 이동할 수 neuroblasts에 상승을 제공합니다. 이러한 장거리 이동은 OB 신생아 신경의 후속 성숙에 필요하지만,이 과정을 조절 분자 메커니즘은 아직 불분명된다. neuroblast 운동성을 조절하는 신호 전달 경로를 조사하는 신경의 기본적인 단계를 이해하는 데 도움이뿐만 아니라, 부상, 뇌졸중, 또는 변성에 의해 영향을받는 뇌의 사이트를 대상으로하도록 neuroblasts의 능력 부여, 치료 회생 가능성이 있습니다뿐만 아니라.
이 논문에서 우리는 생체 내 출생의 일렉트로 마우스 RMS의 neuroblast 마이그레이션 이후의 시간 경과 영상에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 출생 일렉트로 효율적 SVZ 조상 형질 할 수 있습니다다시 RMS를 따라 이주 neuroblasts을 생성하는 세포. 급성 뇌 슬라이스 문화의 디스크 시간 경과 현미경을 회전 공 촛점을 사용 neuroblast 마이그레이션 밀접하게 생체 조건과 유사한 환경에서 모니터링 할 수 있습니다. 또한, neuroblast 운동성 추적 및 정량적으로 분석 할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 RMS를 따라 이주 neuroblasts 레이블을 시각화하기 위해 GFP를 발현하는 플라스미드의 생체 내 출생의 전기 충격을 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 에 loxP 시스템을 사용하는 조건부 녹아웃 마우스에 shRNA를 또는 CRE 재조합 효소를 발현하는 플라스미드의 일렉트로 또한 관심의 유전자를 대상으로 할 수 있습니다. 급성 뇌 슬라이스 배양 물의 약리 조작 neuroblast 이주 다른 시그널링 분자의 역할을 조사하기 위하여 수행 될 수있다. 시간 경과 영상과 생체 전기 충격에 결합함으로써, 우리는 neuroblast 운동성을 조절하는 분자 메커니즘을 이해하고 개발에 기여할 수 있도록 노력하겠습니다소설의, 표준은 뇌의 복구를 촉진하기 위해 접근한다.
Introduction
포유 동물의 뇌에 새로운 뉴런 (신경)의 발생은 주로 두 지역에서 출생 후 발생, 해마 1의 치아 이랑 (dentate gyrus)의 좌우 심실과 subgranular 영역의 subventricular 영역 (SVZ). 최근 몇 년 동안 수집 된 증거는 해마와 후각 망울 메모리 기능 1-3 출생 후 신경을위한 중요한 역할을 지원합니다. 중요한 것은, 출생 후 신경은 치료 때문에 퇴행성 신경 질환과의 관계의 가능성, 뇌 4-6 부상 사이트를 마이그레이션 할 neuroblasts의 능력을 보유하고있다.
subventricular 영역 (SVZ)는 최근 중요한 신경성 틈새 시장으로 떠오르고있다. SVZ 파생 neuroblasts이 출생 후의 뇌 -1,7,8,8에서 가장 긴 마이그레이션 프로세스 만들기, 주동이의 철새 스트림 (RMS)를 통해 후각 망울 (OB)를 향해 이동한다. 포유류의 SVZ / RMS / OB 시스템이되고있다이러한 증식, 이동 및 분화 1,8 등의 신경에있는 다른 단계를 공부하는 유용한 모델. 많은 성장 인자와 세포 외 신호는 RMS를 따라 SVZ 신경과 이동을 조절하지만, 세포 내 분자 메커니즘은 지금까지 완벽하게되는 1.9을 이해합니다. RMS에 따라 적절한 이주 신생아 뉴런 (10)의 연속적인 성숙을 위해 매우 중요합니다. 또한, 일부 연구는 SVZ 파생 neuroblasts가 뇌 손상 사이트 4-6,11-13에 RMS 밖으로 마이그레이션 할 수있는 것으로 나타났습니다. 따라서, 신호 전달 메커니즘의 조절 neuroblast 마이그레이션을 조사하는 것은 신경을 이해할뿐만 아니라 기본적인뿐만 아니라 잠재적 인 치료 응용 프로그램입니다.
여기, 우리는 생체 내 출생을 전기 SVZ 신경 전구 세포를 라벨 및 시간 경과 회전 디스크 공 촛점 microsco를 사용하여 급성 뇌 슬라이스 문화의 RMS를 따라 그들의 이동을 감시하기위한 세부 프로토콜을 설명평. 일렉트로 널리 배아에서 성인 단계 (14-18)에 발달 연구에 사용됩니다. 그것은 SVZ 신경 전구 세포를 대상으로 조작 할 수있는 강력한 도구입니다 및 형질 전환 모델 1,15,19,20의 바이러스 성 벡터 또는 생성의 정위 주입 저렴하고 상당히 빠른 대안을 나타냅니다. 그것은 수술을 필요로하고 높은 생존율이없는 비교적 간단한 절차입니다. shRNA를 나에 loxP 시스템이 관심의 유전자를 대상으로하거나 SVZ 조상의 영구 라벨을 달성하기 위해, 따라서 성인 신경 연구 (21, 22)를위한 유용한 도구를 나타내는 데 사용할 수 있습니다 채용 마우스 유전자 모델에서 CRE 재조합 효소를 발현하는 플라스미드의 일렉트로.
그대로 뇌 이미징 RMS의 neuroblast 마이그레이션은 여전히 인해 현재 기술적 한계에 도전합니다. 그러나,이 공정은 적당한 SYST 제공 급성 뇌 조각의 촛점 회전 디스크 경과 현미경을 사용하여 모니터링 할 수있다EM은 밀접하게 약물 조작 (23, 24)에 또한 의무가 생체 내 조건을 닮은. 시간 경과 영상과 생체 출생 일렉트로의 커플 링 neuroblast 운동성을 조절하는 분자 메커니즘에 대한 이해를 촉진하고 뇌의 복구를 촉진하기 위해 새로운 접근 방법의 발전에 기여할 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
RMS를 따라 신경 전구 세포의 효율적인 마이그레이션 기능 신경 (10)에 자신의 후속 성숙을 보장합니다. OB 향하는 신경 전구 세포의 탁월한 스트림은 인간의 초기 단계에 볼 수 있습니다 초기 출생 후의 인간의 두뇌 발달 (27)에 중요한 역할을 할 가능성이있다. 또한,이 세포는 손상과 신경 퇴행의 4,28에 의해 영향을받는 뇌의 사이트를 대상으로 할 수 있습니다. 실시간으로 n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MS와 YZ는 KCL과 KCL 중국 박사 studentships에 의해 지원된다. MO는 생물 공학 및 생물 과학 연구 협의회의 박사 과정 학생이기 의해 투자되었다. 우리는 일렉트로에 귀중한 조언을 마사루 오카베 및 월 이치 미야자키 PCX-EGFP 플라스미드 및 알랭 Chedotal와 아테나 입실 랜티 감사합니다.
Materials
| Millicell | Millipore | PICM0RG50 | |
| 35 mm Glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-14-C | |
| Gey's Balanced media | Sigma | G9779-500ML | |
| Glucose, 45% | Sigma | G8769-100ML | |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | |
| Pen/Strep | GIBCO | 15140-122 | |
| FCS | GIBCO | 10109-163 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM (phenol red-free) | GIBCO | 31053-028 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Glass capillaries for injection | Harvard Apparatus | 30-0057 | |
| Aspirator tube | Sigma | A5177 | |
| Sutter P-97 capillary puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Platinum Tweezertrodes 7 mm | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Footswitch Model 1250F | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Gel for electrodes | Cefar Compex | 6602048 | |
| Isoflurane | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Glue | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX spinning disk system | Perkin Elmer | Customized setup (multiple laser sources can be used) equipped with Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD camera | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Acquisition, Quantitation, Visualization Modules | |
| Environmental chamber for microscopy | Solent Scientific | Custom-made | |
| Ti-E inverted microscope | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA objective is recommended for the application described in this paper |
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