واستخدمت تقنيات الفحص المجهري ومعالجة الصور الفاصلة زمنيا لمراقبة وتحليل ضغط هلامي بوساطة الخلايا الليفية وإعادة تنظيم ألياف الفيبرين في مفاعل حيوي خاضع للرقابة البيئية على مدى فترة 48 ساعة.
الخلايا المضمنة في الكولاجين والمواد الهلامية الفيبرين نعلق وممارسة قوى الجر على ألياف الجل. ويمكن أن تؤدي هذه القوى إلى إعادة تنظيم وإعادة تنظيم الهيكل المجهري الهلامي على الصعيدين المحلي والعالمي. هذه العملية تسير بطريقة معقدة تعتمد جزئيا على التفاعل بين موقع الخلايا، وهندسة الجل، والقيود الميكانيكية على الجل. لفهم أفضل لكيفية إنتاج هذه المتغيرات لأنماط محاذاة الألياف العالمية، نستخدم المجهر التبايني للتداخل الفاصل الزمني (DIC) إلى جانب مفاعل حيوي يتم التحكم فيه بيئيا لمراقبة عملية الضغط بين النباتات المجهرية المتباعدة هندسيا (مجموعات من الخلايا الليفية). ثم يتم تحليل الصور مع خوارزمية معالجة الصور المخصصة للحصول على خرائط للإجهاد. ويمكن استخدام المعلومات التي تم الحصول عليها من هذه التقنية للتحقيق في علم الأحياء الميكانيكية لمختلف التفاعلات مصفوفة الخلية، والتي لها آثار هامة لفهم العمليات في التئام الجروح، وتطوير الأمراض، وتطبيقات هندسة الأنسجة.
أداة هامة لدراسة التفاعلات مصفوفة الخلية هو هلام الكولاجين المأهولة بالخلايا1،2. الجل يوفر بيئة 3D التي هي أقرب إلى الطابع في الجسم الحي من الأنسجة وأكثر ملاءمة لفهم سلوك الخلية مما تقدمه الثقافات التقليدية 2D3. الدراسات المبكرة التي تم توزيعها بشكل متجانس الخلايا الليفية داخل هلام الكولاجين وجدت أن الخلايا توطيد بسرعة ألياف الكولاجين وضغط هلام4,5. الخلايا الليفية انقباش في المواد الهلامية العائمة الحرة ثم الانتقال إلى حالة هادئة بعد فترة وجيزة من هلام وصلت تماما ضغط1,6,7. الخلايا الليفية في المواد الهلامية التي هي مقيدة عند الحدود لا تزال في حالة نشطة، الاصطناعية8 وأنها تولد محاذاة الألياف بطريقة تعتمد على هندسة هلام والقيود الخارجية5،9. الاختلافات في نشاط الخلية ويبدو أن نتيجة للتوتر الداخلي (أو عدمه) التي تتطور كما الخلايا ممارسة قوى الجر عن طريق integrins على ألياف الكولاجين في هلام.
وهناك متغير من هذه التقنية ينطوي على وضع explants الخلايا الليفية(أي كتل من الخلايا) على مسافة بعيدا داخل هلام الكولاجين ومراقبة التفاعلات الخلية مصفوفة والتطور التدريجي للمحاذاة الألياف بين explants (تسمى أحيانا الأشرطة مثل الرباط)10-12. الميزة الأساسية للنظام explant هو أنه يسمح للمرء لترتيب الخلايا في أنماط هندسية بسيطة، مما يجعل من الأسهل تصور والتحقيق في الآليات الكامنة وراء إعادة تنظيم الألياف التي تحركها الخلية. هذه الأنماط المحاذاة — التي تعتمد أساسا على التفاعل بين قوى الجر الخلية, توزيع الخلية المكانية, هندسة هلام, والقيود الميكانيكية على هلام — من المهم أن نفهم لأنها تلعب دورا مركزيا في تنظيم الأنسجة العالمية, وظيفة ميكانيكية, والبيئة الميكانيكية المحلية13.
في مجال هندسة الأنسجة ، تتضمن إحدى استراتيجيات إنتاج الأنسجة الوظيفية ميكانيكيا والمهندسة التحكم في نمط محاذاة الألياف الذي يتطور من ضغط الخلايا بحيث تمتلك الأنسجة المهندسة محاذاة الألياف التي تحاكي محاذاة الأنسجة الأصلية14،15. ويعتقد أن مثل هذا المحاذاة ضروري للأنسجة المهندسة لتكرار السلوك الميكانيكي المعقد للأنسجة الأصلية. تعديل هذه الاستراتيجية هو استبدال هلام الكولاجين مع هلام الفيبرين16. هلام الفيبرين يطور نمط محاذاة مماثل لهلام الكولاجين أثناء الضغط. مع مرور الوقت هو المتدهورة الفيبرين واستبدالها مع ECM توليفها الخلية التي تتبع نمط محاذاة الألياف الفيبرين الأولية. وقد أدى البناء المهندس الناتج إلى تحسين الخصائص الميكانيكية بشكل كبير مقارنة ببنيات هلام الكولاجين المشتقة17.
عملية المحاذاة والأحداث إعادة عرض لاحقة في المواد الهلامية الفيبرين المضي قدما بطريقة معقدة وغير مفهومة بشكل جيد. لتوصيف هذه التفاعلات بشكل أفضل وتأثيرها على سلوك الخلية وإعادة عرض ECM ، قمنا بتطوير إجراء يستند إلى طريقة الزرع. في هذه الطريقة، يتم وضع explants الخلايا الليفية على هلام الفيبرين في أنماط هندسية مختلفة. يتم الحفاظ على المواد الهلامية في مفاعل حيوي18يتم التحكم فيه بيئيا ، ويتم مراقبة عملية الضغط وإعادة تنظيم الألياف باستخدام المجهر التفاضلي للتداخل الفاصل الزمني (DIC). يتم قياس حقول الإزاحة كميا باستخدام خوارزميات مخصصة. البيانات التي تم الحصول عليها من هذه التجارب لها آثار واسعة النطاق على عدد من العمليات، بما في ذلك تحسين استراتيجيات هندسة الأنسجة، وتحسين التئام الجروح، وعلاج إعادة عرض الأنسجة المرضية.
وقد وضع هذا البروتوكول لغرض مراقبة وقياس الميكانيكا التي تنطوي عليها عملية إعادة تشكيل نظام الرصد الأوروبي بوساطة الخلية. هذه العمليات تكمن وراء عدد من الظواهر البيولوجية ولها آثار هامة على الأنسجة الهندسية2,22, الحد منندبة 1,23, وفهم إعادة عرض الأنسجة المرضية12,24. استخدام ا…
The authors have nothing to disclose.
نشكر جورج جوديس وستيفن إلياسون على التبرع بالخلايا الليفية الجلدية البشرية وراميش راغوباثي للمساعدة في خوارزمية تتبع الإجهاد. تم تقديم الدعم لهذا العمل من قبل وزارة التعليم الأميركية مساعدة الدراسات العليا في مجالات الحاجة الوطنية زمالة (GAANN P200A120071).
Sigma-Aldrich | F8630 | |
Sigma-Aldrich | T4648 | |
Gibco | 11965-092 | |
Gibco | 15140-122 | |
Sigma-Aldrich | A2942 | |
Sigma-Aldrich | H0887 | |
Sigma-Aldrich | 223506 | |
Gibco | 25200-056 | |
Invitrogen | 3000 | |
Lonza | DE14-701F | |
Molecular Probes | F8858 | |
GIBCO | A10483-01 | |
GIBCO | 11430-030 | |
Fisher-Scientific | SS264-1 | |
Sigma-Aldrich | A3428-25MG | |
Biotense Bioreactor | ADMET | |
Ti-Eclipe Microscope | Nikon | |
# 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish | MatTek | P35G-0-20-C |
# 0 35 mm Glass Top Petri Dish | MatTek | P35GTOP-0-20-C |
Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends | Cole-Parmer | 30600-65 |