Observation og kvantificering fibroblast-medieret Fibrin Gel Compaction

Summary

Time-lapse mikroskopi og billedbehandling teknikker blev brugt til at observere og analysere fibroblast-medieret gel komprimering og fibrin fiber justering i en miljøkontrolleret bioreaktor over en 48 timers periode.

Abstract

Celler indlejret i kollagen og fibrin geler vedhæfte og udøve trækkraft kræfter på fibrene i gelen. Disse kræfter kan føre til lokal og global reorganisering og justering af gelmikrostrukturen. Denne proces fortsætter på en kompleks måde, der til dels afhænger af samspillet mellem cellernes placering, gelens geometri og de mekaniske begrænsninger på gelen. For bedre at forstå, hvordan disse variabler producerer globale fiberjusteringsmønstre, bruger vi DIC-mikroskopi (time-lapse differential interference contrast) kombineret med en miljøstyret bioreaktor til at observere komprimeringsprocessen mellem geometrisk fordelte explants (klynger af fibroblaster). Billederne analyseres derefter med en brugerdefineret billedbehandlingsalgoritme for at få kort over stammen. Oplysningerne fra denne teknik kan bruges til at undersøge mekanobiologien af forskellige cellematrixinteraktioner, hvilket har vigtige konsekvenser for forståelsesprocesser i sårheling, sygdomsudvikling og vævstekniske applikationer.

Introduction

Et vigtigt redskab til at studere celle-matrix interaktioner er cellen befolket kollagen gel^1,2. Gelen giver et 3D-miljø, der er tættere på vævets in vivo-karakter og bedre egnet til at forstå celleadfærd end traditionelle 2D-kulturer³. Tidlige undersøgelser, hvor fibroblaster blev homogent fordelt i en kollagen gel fandt, at cellerne hurtigt konsolidere kollagen fibre og komprimere gel^4,5. Den kontraktile fibroblaster i frit flydende geler derefter overgangen til en hvilende tilstand kort efter gelen er fuldt nået komprimering^1,6,7. Fibroblasterne i geler, der er begrænset ved grænserne, forbliver i en aktiv, syntetisk tilstand^8, og de genererer fiberjustering på en måde, der er afhængig af gelgeometri og eksterne begrænsninger^5,9. Forskelle i celleaktivitet synes at være et resultat af den interne spænding (eller mangel på samme), der udvikler sig som cellerne udøver trækkraft kræfter via integrins på kollagen fibre i gelen.

En variant af denne teknik indebærer at placere fibroblast explants(dvs. klumper af celler) en afstand fra hinanden i en kollagen gel og observere celle-matrix interaktioner og den gradvise udvikling af fiber tilpasning mellem explants (undertiden kaldet ligament-lignende stropper)^10-12. Den primære fordel ved det eksplante system er, at det giver en mulighed for at arrangere cellerne i enkle geometriske mønstre, hvilket gør det lettere at visualisere og undersøge de mekanismer, der ligger til grund for celledrevet fiberjustering. Disse tilpasningsmønstre – som primært afhænger af samspillet mellem celletrækkræfter, celle rumlig distribution, gelgeometri og de mekaniske begrænsninger på gelen – er vigtige at forstå, fordi de spiller en central rolle i den globale vævsorganisation, mekanisk funktion og lokalt mekanisk miljø¹³.

Inden for vævsteknik involverer en strategi for fremstilling af mekanisk funktionelle, manipulerede væv at kontrollere fiberjusteringsmønsteret, der udvikler sig fra cellekomprimering, så det manipulerede væv besidder fiberjustering, der efterligner det indfødte væv^14,15. En sådan tilpasning menes nødvendig for manipuleret væv til at kopiere den komplekse mekaniske adfærd indfødte væv. En ændring af denne strategi er at erstatte kollagen gel med en fibrin gel¹⁶. Fibrin gelen udvikler et lignende justeringsmønster som en kollagengel under komprimering. Over tid fibrin nedbrydes og erstattes med celle-syntetiseret ECM, der følger den oprindelige fibrin fiber justering mønster. Den resulterende konstrueret konstruktion har væsentligt forbedret mekaniske egenskaber i forhold til kollagen gel afledt konstruktioner¹⁷.

Tilpasningsprocessen og efterfølgende ombygningshændelser i fibrin geler fortsætter på en kompliceret og dårligt forstået måde. For bedre at karakterisere disse interaktioner og deres virkning på celleadfærd og ECM-remodeling har vi udviklet en procedure, der er baseret på explant-metoden. I denne metode er fibroblast explants placeret på en fibrin gel i forskellige geometriske mønstre. Gelerne vedligeholdes i en miljøkontrolleret, mikroskopmonteret bioreaktor¹⁸, og komprimerings- og fiberjusteringsprocessen overvåges med time-lapse differentialinterferenskontrastkontrast (DIC) mikroskopi. Forskydningsfelter kvantificeres med brugerdefinerede algoritmer. De data, der er opnået fra disse eksperimenter, har vidtrækkende konsekvenser for en række processer, herunder optimering af vævstekniske strategier, forbedring af sårheling og behandling af patologisk vævs remodeling.

Protocol

1. Forberedelse af stencil Forbered en stencil på Parafilm til layout placeringen af hver explant, efter den ønskede geometri (Figur 1A og 1B). Plads hver explant ca 1-2 mm fra hinanden. Denne afstand svarer til en ideel afstand til generering af fiberjustering mellem explants. Sæt stencilen under det område af dækglasset, hvor prøven skal tilberedes med tape. 2. Sterilisering Rengør a…

Representative Results

Vævs remodeling er en kompleks proces, der til dels drives af gensidige fysiske interaktioner mellem celler og den omgivende matrix. Cellerne reorganiserer de omkringliggende fibre og genererer spændinger i fibernetværket. Tilpasningen af fibre og mekanisk miljø styrer igen celleadfærd, så både celler og matrix globalt reorganiseres for at producere ombygget væv. I dette eksperiment begyndte explanternes celler, oprindeligt runde i morfologi, at strække sig ind i gelen og overholde de fibrinfibre (Figur …

Discussion

Denne protokol blev udviklet med det formål at observere og kvantificere de mekanikere, der er involveret i cellemedieret ECM-ombygning. Sådanne processer ligger til grund for en række biologiske fænomener og har stor betydning for vævevæv^2,22, hvilket reducerer ar^1,23og forstår patologisk vævs remodeling^12,24. Brugen af time-lapse DIC mikroskopi giver en mulighed for at løse og kvantificere forskydning og tilpasning af fibrin fibre, der opstår som følge af celle trækkraft kr?…

Materials

Sigma-Aldrich	F8630
Sigma-Aldrich	T4648
Gibco	11965-092
Gibco	15140-122
Sigma-Aldrich	A2942
Sigma-Aldrich	H0887
Sigma-Aldrich	223506
Gibco	25200-056
Invitrogen	3000
Lonza	DE14-701F
Molecular Probes	F8858
GIBCO	A10483-01
GIBCO	11430-030
Fisher-Scientific	SS264-1
Sigma-Aldrich	A3428-25MG
Biotense Bioreactor	ADMET
Ti-Eclipe Microscope	Nikon
# 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish	MatTek	P35G-0-20-C
# 0 35 mm Glass Top Petri Dish	MatTek	P35GTOP-0-20-C
Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends	Cole-Parmer	30600-65