Observeren en kwantificeren van fibroblast-gemedieerde Fibrin Gel Compaction
Summary
Time-lapse microscopie- en beeldverwerkingstechnieken werden gebruikt om fibroblastgemedieerde gelverdichting en fibrinevezelherschikking in een milieuvriendelijke bioreactor gedurende een periode van 48 uur te observeren en te analyseren.
Abstract
Cellen ingebed in collageen en fibrinegels hechten en oefenen tractiekrachten uit op de vezels van de gel. Deze krachten kunnen leiden tot lokale en wereldwijde reorganisatie en herschikking van de gelmicrostructuur. Dit proces verloopt op een complexe manier die deels afhankelijk is van het samenspel tussen de locatie van de cellen, de geometrie van de gel en de mechanische beperkingen op de gel. Om beter te begrijpen hoe deze variabelen globale vezeluitlijningspatronen produceren, gebruiken we time-lapse differentiële interferentiecontrast (DIC) microscopie in combinatie met een milieugestuurde bioreactor om het verdichtingsproces tussen geometrisch verdeelde explants (clusters van fibroblasten) te observeren. De afbeeldingen worden vervolgens geanalyseerd met een aangepast beeldverwerkingsalgoritme om kaarten van de stam te verkrijgen. De informatie verkregen uit deze techniek kan worden gebruikt om de mechanobiologie van verschillende celmatrixinteracties te onderzoeken, wat belangrijke implicaties heeft voor het begrijpen van processen in wondgenezing, ziekteontwikkeling en weefseltechnologietoepassingen.
Introduction
Een belangrijk hulpmiddel voor het bestuderen van cel-matrix interacties is de cel bevolkte collageen gel1,2. De gel biedt een 3D-omgeving die dichter bij het in vivo karakter van het weefsel ligt en beter geschikt is voor het begrijpen van celgedrag dan wordt aangeboden door traditionele 2D-culturen3. Vroege studies waarin fibroblasten homogeen werden verdeeld in een collageengel, ontdekten dat de cellen de collageenvezels snel consolideren en de gelverdichten 4,5. De contractiele fibroblasten in vrij zwevende gels gaan dan over in een rustgevende toestand kort nadat de gel volledig verdichting1,6,7heeft bereikt. De fibroblasten in gels die aan de grenzen zijn beperkt, blijven in een actieve, synthetische toestand8 en ze genereren vezeluitlijning op een manier die afhankelijk is van gelgeometrie en externe beperkingen5,9. Verschillen in celactiviteit lijken het gevolg te zijn van de interne spanning (of het ontbreken daarvan) die zich ontwikkelt naarmate de cellen tractiekrachten uitoefenen via integrinen op de collageenvezels in de gel.
Een variant van deze techniek omvat het plaatsen van fibroblast explants(d.w.z. klonten cellen) op een afstand van elkaar binnen een collageengel en het observeren van celmatrixinteracties en de geleidelijke ontwikkeling van vezeluitlijning tussen de explants (soms ligamentachtige banden genoemd)10-12. Het belangrijkste voordeel van het explantsysteem is dat het iemand in staat stelt om de cellen in eenvoudige geometrische patronen te rangschikken, waardoor het gemakkelijker wordt om de mechanismen die ten grondslag liggen aan celgestuurde vezelherschikking te visualiseren en te onderzoeken. Deze uitlijningspatronen – die voornamelijk afhankelijk zijn van het samenspel tussen celtractiekrachten, cel ruimtelijke verdeling, gelgeometrie en de mechanische beperkingen op de gel – zijn belangrijk om te begrijpen omdat ze een centrale rol spelen in de wereldwijde weefselorganisatie, mechanische functie en lokale mechanische omgeving13.
Op het gebied van weefseltechniek omvat één strategie voor het produceren van mechanisch functionele, gemanipuleerde weefsels het controleren van het vezeluitlijningspatroon dat zich ontwikkelt uit celverdichting, zodat het gemanipuleerde weefsel vezeluitlijning bezit die die van het inheemse weefselnabootst 14,15. Een dergelijke uitlijning wordt verondersteld noodzakelijk voor gemanipuleerde weefsels om het complexe mechanische gedrag van inheemse weefsels te repliceren. Een wijziging van deze strategie is om de collageengel te vervangen door een fibrinegel16. De fibrinegel ontwikkelt een vergelijkbaar uitlijningspatroon als een collageengel tijdens verdichting. Na verloop van tijd wordt de fibrine afgebroken en vervangen door celgesynthetiseerde ECM die het initiële fibrinevezeluitlijningspatroon volgt. De resulterende ontworpen constructie heeft aanzienlijk verbeterde mechanische eigenschappen in vergelijking met collageengel afgeleide constructies17.
Het uitlijningsproces en de daaropvolgende renovatiegebeurtenissen in fibrinegels verlopen op een gecompliceerde en slecht begrepen manier. Om deze interacties en hun effect op celgedrag en ECM-remodellering beter te karakteriseren, hebben we een procedure ontwikkeld die is gebaseerd op de explantmethode. Bij deze methode worden fibroblast explants op een fibrinegel geplaatst in verschillende geometrische patronen. De gels worden onderhouden in een milieugecontroleerde, op een microscoop gemonteerde bioreactor18,en het proces van verdichting en vezelherschikking wordt bewaakt met time-lapse differentiële interferentiecontrast (DIC) microscopie. Verplaatsingsvelden worden gekwantificeerd met aangepaste algoritmen. De gegevens die uit deze experimenten worden verkregen, hebben uiteenlopende implicaties voor een aantal processen, waaronder het optimaliseren van weefselengineeringsstrategieën, het verbeteren van wondgenezing en het behandelen van pathologische weefselremodellering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol is ontwikkeld met het oog op het observeren en kwantificeren van de mechanica die betrokken is bij celgemedieerde ECM-remodellering. Dergelijke processen liggen ten grondslag aan een aantal biologische verschijnselen en hebben belangrijke implicaties voor technische weefsels2,22, waardoor litteken1,23wordt verminderd , en inzicht in pathologische weefselremodellering12,24. Het gebruik van time-lapse DIC-microscopie stelt iemand in staat om de verplaatsing en uitlijning van fi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken George Giudice en Steven Eliason voor het doneren van menselijke huidfibroblasten en Ramesh Raghupathy voor hulp bij het algoritme voor het volgen van de stam. Ondersteuning voor dit werk werd verleend door een U.S. Department of Education Graduate Assistance in Areas of National Need Fellowship (GAANN P200A120071).
Materials
| Sigma-Aldrich | F8630 | |
| Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Gibco | 11965-092 | |
| Gibco | 15140-122 | |
| Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Gibco | 25200-056 | |
| Invitrogen | 3000 | |
| Lonza | DE14-701F | |
| Molecular Probes | F8858 | |
| GIBCO | A10483-01 | |
| GIBCO | 11430-030 | |
| Fisher-Scientific | SS264-1 | |
| Sigma-Aldrich | A3428-25MG | |
| Biotense Bioreactor | ADMET | |
| Ti-Eclipe Microscope | Nikon | |
| # 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish | MatTek | P35G-0-20-C |
| # 0 35 mm Glass Top Petri Dish | MatTek | P35GTOP-0-20-C |
| Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends | Cole-Parmer | 30600-65 |
References
- Grinnell, F., Petroll WM, . Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2001).
- Sander, E. A., Barocas, V. H. . Biomimetic collagen tissues: collagenous tissue engineering and other applications. In: Collagen: Structure and Mechanics. , (2008).
- Pedersen JA, ., Swartz MA, . Mechanobiology in the third dimension. Ann. Biomed. Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).
- Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (3), 1274 (1979).
- Guidry, C., Grinnell, F. Studies on the mechanism of hydrated collagen gel reorganization by human skin fibroblasts. J. Cell. Sci. 79 (1), 67-81 (1985).
- Fluck, J., Querfeld, C., Cremer, A., Niland, S., Krieg, T., Sollberg, S. Normal human primary fibroblasts undergo apoptosis in three-dimensional contractile collagen gels. J. Invest. Dermatol. 110 (2), 153-157 (1998).
- Rosenfeldt, H., Grinnell, F. Fibroblast quiescence and the disruption of ERK signaling in mechanically unloaded collagen matrices. J. Biol. Chem. 275 (5), 3088-3092 (2000).
- Nakagawa, S., Pawelek, P., Grinnell, F. Long-term culture of fibroblasts in contracted collagen gels: Effects on cell growth and biosynthetic activity. J. Invest. Dermatol. 93 (6), 792-798 (1989).
- Harris, A. K., Stopak, D., Wild, P. Fibroblast traction as a mechanism for collagen morphogenesis. Nature. 290, 249-251 (1981).
- Stopak, D., Harris AK, . Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction: I. tissue culture observations. Dev. Biol. 90 (2), 383-398 (1982).
- Sawhney, R. K., Howard, J. Slow local movements of collagen fibers by fibroblasts drive the rapid global self-organization of collagen gels. J. Cell. Biol. 157 (6), 1083-1092 (2002).
- Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys. J. 95 (11), 5374 (2008).
- Sander, E., Barocas, V., Tranquillo, R. Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension. Ann. Biomed. Eng. 39 (2), 714-729 (2011).
- Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance. J. Biomech. Eng. 119, 137-146 (1997).
- Neidert, M. R., Tranquillo, R. T. Tissue-engineered valves with commissural alignment. Tissue Eng. 12 (4), 891-903 (2006).
- Robinson PS, ., Robinson PS, . Planar biaxial behavior of fibrin-based tissue-engineered heart valve leaflets. Tissue Eng. Part A. 15 (10), 2763-2772 (2009).
- Grassl, E., Oegema, T., Tranquillo, R. Fibrin as an alternative biopolymer to type I collagen for the fabrication of a media equivalent. J. Biomed. Mater. Res. 60 (4), 607-612 (2002).
- Paten, J. A., Zareian, R., Saeidi, N., Melotti, S. A., Ruberti, J. W. Design and performance of an optically accessible, low-volume, mechanobioreactor for long-term study of living constructs. Tissue Eng. Part C Methods. 17 (7), 775-788 (2001).
- Ye KY, ., Sulli van KE, ., Black LD, . Encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering. J. Vis. Exp. (55), (2011).
- Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3261-3270 (2010).
- Raghupathy, R., Witzenburg, C., Lake, S. P., Sander, E. A., Barocas, V. H. Identification of regional mechanical anisotropy in soft tissue analogs. J. Biomech. Eng. 133, (2011).
- Robinson, P. S., Johnson, S. L., Evans, M. C., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. Functional tissue-engineered valves from cell-remodeled fibrin with commissural alignment of cell-produced collagen. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 83-95 (2008).
- Gabbiani, G. The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases. J. Pathol. 200 (4), 500-503 (2003).
- PaszeK, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Grinnell, F., Rocha L, B., Iucu, C., Rhee, S., Jiang, H. Nested collagen matrices: A new model to study migration of human fibroblast populations in three dimensions. Exp. Cell. Res. 312 (1), 86-94 (2006).
- Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices. Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).
- Wakatsuki, T., Kolodney MS, ., Zahalak GI, ., Elson EL, . Cell mechanics studied by a reconstituted model tissue. Biophys. J. 79 (5), 2353-2368 (2000).
- De Jesus, A., Aghvami, M., Sander, E. Fibroblast-mediated fiber realignment in fibrin gels. , (2013).
- Aghvami, M., Barocas, V. H., Sander, E. A. Multiscale mechanical simulations of cell compacted collagen gels. J. Biomech. Eng. 135, (2013).
