Beobachtung und Quantifizierung von Fibroblasten-vermittelter Fibrin-Gelverdichtung

Summary

Zeitraffermikroskopie und Bildverarbeitungstechniken wurden eingesetzt, um die fibroblast-vermittelte Gelverdichtung und Die Fibrinfaser-Neuausrichtung in einem umweltkontrollierten Bioreaktor über einen Zeitraum von 48 Stunden zu beobachten und zu analysieren.

Abstract

Zellen, die in Kollagen- und Fibringelen eingebettet sind, befestigen und üben Zugkräfte auf die Fasern des Gels aus. Diese Kräfte können zu einer lokalen und globalen Reorganisation und Neuausrichtung der Gelmikrostruktur führen. Dieser Prozess verläuft auf komplexe Weise, die zum Teil vom Zusammenspiel zwischen der Position der Zellen, der Geometrie des Gels und den mechanischen Einschränkungen des Gels abhängt. Um besser zu verstehen, wie diese Variablen globale Faserausrichtungsmuster erzeugen, verwenden wir die DIC-Mikroskopie (Time-lapse Differential Interference Contrast) in Verbindung mit einem umweltkontrollierten Bioreaktor, um den Verdichtungsprozess zwischen geometrisch verteilten Explants (Cluster von Fibroblasten) zu beobachten. Die Bilder werden dann mit einem benutzerdefinierten Bildverarbeitungsalgorithmus analysiert, um Karten der Sorte zu erhalten. Die aus dieser Technik gewonnenen Informationen können verwendet werden, um die Mechanobiologie verschiedener Zell-Matrix-Wechselwirkungen zu untersuchen, was wichtige Implikationen für das Verständnis von Prozessen in der Wundheilung, Krankheitsentwicklung und Gewebetechnik-Anwendungen hat.

Introduction

Ein wichtiges Werkzeug zur Untersuchung von Zell-Matrix-Wechselwirkungen ist das zellbevölkerte Kollagengel^1,2. Das Gel bietet eine 3D-Umgebung, die näher am In-vivo-Charakter des Gewebes ist und besser zum Verständnis des Zellverhaltens geeignet ist, als es traditionelle 2D-Kulturen³bieten. Frühe Studien, in denen Fibroblasten homogen in einem Kollagengel verteilt wurden, ergaben, dass die Zellen die Kollagenfasern schnell konsolidieren und das Gel^{verdichten 4,5}. Die kontraktilen Fibroblasten in frei schwebenden Gelen übergehen dann in einen Ruhezustand, kurz nachdem das Gel die Verdichtung vollständig erreicht hat^1,6,7. Die Fibroblasten in Gelen, die an den Grenzen eingeschränkt sind, verbleiben in einem aktiven, synthetischen Zustand⁸ und erzeugen faseralignment in einer Weise, die von der Gelgeometrie und externen Abhängigkeiten abhängig ist^5,9. Unterschiede in der Zellaktivität scheinen eine Folge der inneren Spannung (oder des Fehlens davon) zu sein, die sich entwickelt, wenn die Zellen Zugkräfte über Integrine auf die Kollagenfasern im Gel ausüben.

Eine Variante dieser Technik besteht darin, Fibroblastenexplanten(d.h. Zellklumpen) einen Abstand innerhalb eines Kollagengels zu platzieren und Zell-Matrix-Wechselwirkungen zu beobachten und die allmähliche Entwicklung der Faserausrichtung zwischen den Explants (manchmal auch bänderähnliche Riemen genannt)^10-12zu beobachten. Der Hauptvorteil des Explantationssystems besteht darin, dass es ermöglicht, die Zellen in einfache geometrische Muster anzuordnen, was es einfacher macht, die Mechanismen, die der zellgesteuerten Faserneuausrichtung zugrunde liegen, zu visualisieren und zu untersuchen. Diese Ausrichtungsmuster, die in erster Linie vom Zusammenspiel von Zellzugkräften, zellräumlicher Verteilung, Gelgeometrie und den mechanischen Einschränkungen des Gels abhängen, sind wichtig zu verstehen, da sie eine zentrale Rolle in der globalen Gewebeorganisation, der mechanischen Funktion und der lokalen mechanischen Umgebung¹³spielen.

Im Bereich der Tissue-Engineering, eine Strategie für die Herstellung von mechanisch funktionalen, technischen Geweben beinhaltet die Kontrolle der Faserausrichtung Muster, die aus der Zellverdichtung entwickelt, so dass das technische Gewebe besitzt Faserausrichtung, die die des nativen Gewebes^{imitiert 14,15}. Eine solche Ausrichtung wird für technische Gewebe als notwendig angesehen, um das komplexe mechanische Verhalten nativer Gewebe zu replizieren. Eine Änderung dieser Strategie ist es, das Kollagengel durch ein Fibrin-Gel zu ersetzen¹⁶. Das Fibrin-Gel entwickelt ein ähnliches Ausrichtungsmuster wie ein Kollagengel während der Verdichtung. Im Laufe der Zeit wird das Fibrin abgebaut und durch zellsynthetisiertes ECM ersetzt, das dem anfänglichen Fibrinfaserausrichtungsmuster folgt. Das resultierende konstruierte Konstrukt hat die mechanischen Eigenschaften im Vergleich zu Kollagen-Gel-abgeleiteten Konstrukten deutlich verbessert¹⁷.

Der Ausrichtungsprozess und die anschließenden Umbauereignisse in Fibringelen verlaufen auf komplizierte und schlecht verstandene Weise. Um diese Wechselwirkungen und ihre Auswirkungen auf das Zellverhalten und die ECM-Umgestaltung besser zu charakterisieren, haben wir ein Verfahren entwickelt, das auf der Explant-Methode basiert. Bei dieser Methode werden Fibroblastenexplants auf einem Fibringel in verschiedenen geometrischen Mustern positioniert. Die Gele werden in einem umweltgesteuerten, mikroskopisch montierten Bioreaktor¹⁸gehalten und der Prozess der Verdichtung und Faserneuausrichtung wird mit der Zeitraffer-Differentialinterferenzkontrastmikroskopie (DIC) überwacht. Verschiebungsfelder werden mit benutzerdefinierten Algorithmen quantifiziert. Die aus diesen Experimenten gewonnenen Daten haben weitreichende Auswirkungen auf eine Reihe von Prozessen, einschließlich der Optimierung von Tissue-Engineering-Strategien, der Verbesserung der Wundheilung und der Behandlung pathologischer Gewebeumbauten.

Protocol

1. Schablonenvorbereitung Bereiten Sie eine Schablone auf Parafilm vor, um die Position jeder Explant nach der gewünschten Geometrie(Abbildungen 1A und 1B) zu erstellen. Raum jeder Explant ca. 1-2 mm auseinander. Dieser Abstand entspricht einem idealen Abstand zur Erzeugung der Faserausrichtung zwischen Explants. Befestigen Sie die Schablone unter dem Bereich des Deckglases, wo die Probe mit Klebeband vorbereitet wird. <p class="jove_title"…

Representative Results

Die Gewebeumgestaltung ist ein komplexer Prozess, der zum Teil durch reziproke physikalische Interaktionen zwischen Zellen und der umgebenden Matrix angetrieben wird. Die Zellen organisieren die umgebenden Fasern neu und erzeugen Spannung im Fasernetz. Die Ausrichtung von Fasern und mechanischer Umgebung steuert wiederum das Zellverhalten, sodass sowohl Zellen als auch Matrix global neu organisiert werden, um remodelliertes Gewebe zu erzeugen. In diesem Experiment begannen sich die Zellen der Explanten, zunächst in der …

Discussion

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Mechanik des zellvermittelten ECM-Umbaus zu beobachten und zu quantifizieren. Solche Prozesse liegen einer Reihe von biologischen Phänomenen zugrunde und haben wichtige Auswirkungen auf das technische Gewebe^2,22, die Verringerung der Narbe^1,23und das Verständnis pathologischer Gewebeumgestaltung^12,24. Der Einsatz der zeitrafferigen DIC-Mikroskopie ermöglicht es, die Verschiebung und Ausrichtung von Fibrinfasern, die als Folge von Zellzugkräfte…

Materials

Sigma-Aldrich	F8630
Sigma-Aldrich	T4648
Gibco	11965-092
Gibco	15140-122
Sigma-Aldrich	A2942
Sigma-Aldrich	H0887
Sigma-Aldrich	223506
Gibco	25200-056
Invitrogen	3000
Lonza	DE14-701F
Molecular Probes	F8858
GIBCO	A10483-01
GIBCO	11430-030
Fisher-Scientific	SS264-1
Sigma-Aldrich	A3428-25MG
Biotense Bioreactor	ADMET
Ti-Eclipe Microscope	Nikon
# 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish	MatTek	P35G-0-20-C
# 0 35 mm Glass Top Petri Dish	MatTek	P35GTOP-0-20-C
Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends	Cole-Parmer	30600-65