섬유아세포 매개 피브린 겔 다짐 관찰 및 정량화
Summary
시간 경과 현미경 검사법과 이미지 처리 기술은 48시간 동안 환경적으로 통제된 생물 반응기에서 섬유아세포 매개 젤 다짐 및 피브린 섬유 재정렬을 관찰하고 분석하는 데 사용되었습니다.
Abstract
콜라겐과 피브린 젤에 내장된 세포는 겔 섬유에 견인력을 부착하고 발휘합니다. 이러한 힘은 젤 미세 구조의 로컬 및 글로벌 재구성 및 재조정으로 이어질 수 있습니다. 이 과정은 세포의 위치, 젤의 형상 및 젤의 기계적 제약 사이의 상호 작용에 부분적으로 의존하는 복잡한 방식으로 진행됩니다. 이러한 변수가 글로벌 섬유 정렬 패턴을 생성하는 방법을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 기하학적으로 간격이 있는 각질(섬유아세포의 클러스터) 사이의 압축 공정을 관찰하기 위해 환경 제어 생물 반응기와 결합된 시간 경과 차동 간섭 콘트라스트(DIC) 현미경 을 사용합니다. 그런 다음 이미지를 사용자 지정 이미지 처리 알고리즘으로 분석하여 변형맵을 가져옵니다. 이 기술에서 얻은 정보는 상처 치유, 질병 개발 및 조직 공학 응용 분야의 프로세스를 이해하는 데 중요한 영향을 미치는 다양한 세포 매트릭스 상호 작용의 기계생물학을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
세포 매트릭스 상호 작용을 연구하기위한 중요한 도구는 세포 채워진 콜라겐 젤1,2이다. 겔은 조직의 생체 내 특성에 더 가깝고 전통적인 2D 배양3에서제공하는 것보다 세포 행동을 이해하는 데 더 적합한 3D 환경을 제공한다. 섬유아세포가 콜라겐 젤 내에서 균질하게 분포된 초기 연구에 따르면 세포는 콜라겐 섬유를 빠르게 통합하고 겔4,5을압축하는 것으로 나타났다. 자유 부동 젤의 수축 섬유 아세포는 겔이 완전히 다짐1,6,7에도달 한 직후 정지 상태로 전환한다. 경계에 제약이 있는 겔의 섬유아세포는 활성, 합성 상태8에 남아 있으며 겔 형상 및 외부 제약 에 의존하는 방식으로 섬유 정렬을 생성합니다5,9. 세포 활동의 차이는 세포가 젤의 콜라겐 섬유에 대한 통합을 통해 견인력을 발휘함에 따라 발생하는 내부 장력(또는 그 부족)의 결과로 나타난다.
이 기술의 변이체는 콜라겐 젤 내에서 떨어져 섬유아세포 이질(즉, 세포의 덩어리)을 배치하고 세포 매트릭스 상호 작용을 관찰하고 각기 (때로는 인대 와 같은 스트랩이라고도 함)10-12사이의 섬유 정렬의 점진적 개발을 포함한다. 각기 시스템의 주요 장점은 세포를 간단한 기하학적 패턴으로 배열할 수 있게 해주므로 세포 중심의 섬유 재조정의 메커니즘을 쉽게 시각화하고 조사할 수 있다는 것입니다. 이러한 정렬 패턴은 주로 세포 견인력, 세포 공간 분포, 겔 형상 및 젤의 기계적 제약 사이의 상호 작용에 의존하며 글로벌 조직, 기계적 기능 및 국소 기계환경에서중심적인 역할을 하기 때문에 이해하는 것이 중요하다.
조직 공학 분야에서, 기계적으로 기능적, 엔지니어링 조직을 생산하기위한 하나의 전략은 엔지니어링 조직이 네이티브 조직의 것을 모방 섬유 정렬을 소유할 수 있도록 세포 다짐에서 발생하는 섬유 정렬 패턴을 제어하는 것을 포함한다14,15. 이러한 정렬은 엔지니어링 된 조직이 네이티브 조직의 복잡한 기계적 행동을 복제하는 데 필요하다고 믿습니다. 이 전략의 변형은 콜라겐 젤을 피브린젤(16)으로대체하는 것이다. 피브린 젤은 다짐 시 콜라겐 젤과 유사한 정렬 패턴을 개발합니다. 시간이 지남에 따라 피브린은 분해되고 초기 피브린 섬유 정렬 패턴을 따르는 세포 합성 ECM로 대체됩니다. 그 결과 엔지니어링 된 구조는 콜라겐 젤 유래 구문(17)에비해 기계적 특성을 크게 향상시켰다.
피브린 젤의 정렬 프로세스 및 후속 리모델링 이벤트는 복잡하고 제대로 이해되지 않은 방식으로 진행됩니다. 이러한 상호 작용과 세포 거동 및 ECM 리모델링에 미치는 영향을 더 잘 특성화하기 위해, 우리는 각성 방법에 기초한 절차를 개발했습니다. 이 방법에서, 섬유아세포 각질은 다른 기하학적 패턴의 피브린 젤에 위치한다. 젤은 환경 제어, 현미경 장착 바이오 반응기(18)에서유지되며, 압축 및 섬유 재정렬 과정은 시간 경과 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 현미경 검사법으로 모니터링됩니다. 변위 필드는 사용자 지정 알고리즘으로 정량화됩니다. 이러한 실험에서 얻은 데이터는 조직 엔지니어링 전략 최적화, 상처 치유 개선 및 병리학 조직 리모델링 을 포함하여 여러 과정에 광범위한 영향을 미칩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 세포 매개 ECM 리모델링과 관련된 역학을 관찰하고 정량화하기 위한 목적으로 개발되었다. 이러한 과정은 다수의 생물학적 현상의 기초와 엔지니어링 조직에 대한 중요한 의미를 갖는다2,22,흉터1,23을감소시키고, 병리학 조직을 리모델링12,24. 시간 경과 DIC 현미경 검사법의 사용은 세포 견인력의 결과로 발생하는 피브린 섬유의 변위와 정렬을 해결하고 정량?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 조지 Giudice와 스티븐 엘리아슨이 변형 추적 알고리즘에 도움을 준 인간의 진피 섬유아세포와 라메쉬 라구병증을 기부해 주셔서 감사합니다. 이 작업에 대한 지원은 국가 필요 펠로우십 분야의 미국 교육부 대학원 지원 (GAANN P200A120071)에 의해제공되었다.
Materials
| Sigma-Aldrich | F8630 | |
| Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Gibco | 11965-092 | |
| Gibco | 15140-122 | |
| Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Gibco | 25200-056 | |
| Invitrogen | 3000 | |
| Lonza | DE14-701F | |
| Molecular Probes | F8858 | |
| GIBCO | A10483-01 | |
| GIBCO | 11430-030 | |
| Fisher-Scientific | SS264-1 | |
| Sigma-Aldrich | A3428-25MG | |
| Biotense Bioreactor | ADMET | |
| Ti-Eclipe Microscope | Nikon | |
| # 0 35 mm Glass Bottom Petri Dish | MatTek | P35G-0-20-C |
| # 0 35 mm Glass Top Petri Dish | MatTek | P35GTOP-0-20-C |
| Plastic Luer fittings, PVC tubing with Luer ends | Cole-Parmer | 30600-65 |
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