एक सभ्य मूत्राशय उपकला भर में मानव न्युट्रोफिल प्रवास के गुणात्मक मूल्यांकन
Summary
हम uropathogenic कोलाई के साथ मूत्राशय के संक्रमण के दौरान तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया का एक महत्वपूर्ण घटक है कि mimics इन विट्रो मॉडल विकसित किया है. transuroepithelial न्युट्रोफिल प्रवास परख जीवाणु संक्रमण या chemoattractant पदार्थों के जवाब में, पारगम्य समर्थन करता है पर सुसंस्कृत, मूत्राशय epithelia भर में मानव न्युट्रोफिल प्रवास के मात्रात्मक आकलन सक्षम बनाता है.
Abstract
सूजन की साइट के लिए परिधि से प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती किसी भी mucosal सतह पर सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक आवश्यक कदम है. मूत्राशय के संक्रमण के दौरान, polymorphonuclear leukocytes (PMN, neutrophils) खून से विस्थापित और मूत्राशय उपकला पार. एक neutrophilic प्रतिक्रिया के अभाव में संक्रमण को हल करने में विफलता मूत्राशय बचाव में PMN के महत्व को दर्शाता है. मूत्राशय उपकला, uropathogenic Escherichia कोलाई (UPEC) के औपनिवेशीकरण की सुविधा, मूत्र पथ के संक्रमण (UTIs) के बहुमत की प्रेरणा का एजेंट, आंशिक रूप से परिभाषित तंत्र की एक किस्म का उपयोग तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया गीला हो जाना. आगे मेजबान और जीवाणु रोगज़नक़ के बीच परस्पर क्रिया की जांच, हम UPEC को सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के इस पहलू की इन विट्रो मॉडल विकसित किया है. Transuroepithelial न्युट्रोफिल प्रवास परख में, Boyden कक्ष पर एक बदलाव, सुसंस्कृत मूत्राशय epithelial कोशिकाओं एक पारगम्य समर्थन के नीचे पर संगम बड़े हो रहे हैं. PMN मानव शिरापरक रक्त से अलग कर रहे हैं और मूत्राशय उपकला सेल परतों के basolateral ओर करने के लिए लागू कर रहे हैं. जीवाणु संक्रमण या chemoattractant अणुओं के जवाब में physiologically प्रासंगिक basolateral करने वाली शिखर दिशा का प्रतिनिधित्व PMN प्रवास एक hemocytometer का उपयोग प्रगणित है. इस मॉडल UPEC और कोशिकाओं के बीच बातचीत की जांच करने के साथ ही PMN से मूत्राशय epithelia की चंक्रमण के लिए आणविक आवश्यकताओं को पूछताछ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. transuroepithelial न्युट्रोफिल प्रवास मॉडल मूत्राशय में UPEC को प्रारंभिक भड़काऊ प्रतिक्रिया के बारे में हमारी समझ को आगे होगा.
Introduction
पूरे शरीर में कोशिकाओं का आंदोलन, अक्सर लंबी दूरी पार, वृद्धि और विकास, घाव भरने, और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक है. सेल प्रवास जटिल है और संकेत cascades और cytoskeletal घटकों के पुनर्निर्माण सहित कई विभिन्न प्रक्रियाओं के समन्वय की आवश्यकता है. प्रकोष्ठों परिभाषित रासायनिक ढ़ाल (कीमोटैक्सिस) की ओर बेतरतीब ढंग से (किसी रासायनिक पदार्थ द्वारा किसी जीव की क्रियाशीलता का बढ़ जाना) को स्थानांतरित करने के साथ ही कर सकते हैं. कई तकनीक इन विट्रो में सेल प्रवास अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है. सबसे पुराना और सबसे आम तकनीक, Boyden कक्ष, एक chemoattractant पदार्थ नीचे कक्ष और ब्याज की कोशिकाओं में रखा गया है जहां एक खड़ी दो कक्ष प्रणाली के होते हैं शीर्ष कक्ष 1 में रखा जाता है. दो कक्षों को अलग परिभाषित आकार के pores के साथ पारगम्य फिल्टर भर में कोशिकाओं के आंदोलन पर नजर रखी जाती है. अतिरिक्त तकनीक Zigmond कक्ष 2 और डन कक्ष सहित सेल प्रवास जांच करने के लिए विकसित किया गया है3. ये सामूहिक दृष्टिकोण कई अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं के आंदोलन में महत्वपूर्ण जानकारी प्राप्त हुए है.
किसी रासायनिक पदार्थ द्वारा किसी जीव की क्रियाशीलता का बढ़ जाना और chemotaxis के बुनियादी सिद्धांतों से पूछताछ करने के अलावा, दो कक्ष assays के बाह्य मैट्रिक्स घटकों और दोनों endothelial और उपकला सेल परतों के माध्यम से सेल प्रवास की जांच में मदद की है. अन्य तकनीकों पर दो कक्ष सिस्टम का एक फायदा झरझरा झिल्ली ऐसे कोलेजन या फाइब्रिनोजेन के रूप में प्रोटीन के साथ लेपित किया जा सकता है, और एक बाह्य मैट्रिक्स की तरह बाधा पार सेल प्रवास का आकलन किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, सभ्य सेल लाइनों से बढ़ा है और पारगम्य समर्थन करता है पर भेदभाव किया जा सकता है. एक endothelial बाधा पार कोशिकाओं के आंदोलन की जांच करने के लिए, सुसंस्कृत endothelial कोशिकाओं पारगम्य समर्थन के ऊपरी जलाशय में वरीयता प्राप्त और बड़े हो रहे हैं. ऐसे प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में चलता – फिरता कोशिकाओं, एन भर में कम जलाशय में ऊपरी जलाशय और प्रवास के लिए जोड़ रहे हैंशारीरिक शिखर करने वाली basolateral दिशा में dothelial बाधा मनाया जाता है. इस मॉडल को रक्त प्रवाह से बाहर प्रतिरक्षा कोशिकाओं के परिस्त्राव समझने में अमूल्य किया गया है. माइग्रेशन transendothelial के विपरीत, एक उपकला बाधा पार कोशिकाओं के आंदोलन को आम तौर पर basolateral करने वाली शिखर दिशा में होता है. इन विट्रो में इन घटनाओं मॉडल के क्रम में, शोधकर्ताओं बीज और पारगम्य समर्थन के नीचे पर सुसंस्कृत उपकला कोशिकाओं को विकसित. चलता – फिरता कोशिकाओं basolateral करने वाली शिखर दिशा का प्रतिनिधित्व उपकला बाधा पार ऊपरी जलाशय और प्रवास, के लिए जोड़ रहे हैं, पर नजर रखी है. Transepithelial प्रवास के इस तरह के मॉडल काफी mucosal सतहों पर भड़काऊ प्रतिक्रियाओं, विशेष रूप से फेफड़ों के उन और 4,5 पेट की हमारी समझ के लिए योगदान दिया है.
इसके विपरीत, मूत्र पथ के उपकला के माध्यम से प्रतिरक्षा सेल की तस्करी काफी कम ध्यान दिया गया है. हमारे understandi आगे करने के लिएएक मूत्राशय उपकला बाधा 6 भर में आंदोलन, (न्युट्रोफिल PMN) एनजी uropathogenic Escherichia कोलाई (UPEC) के साथ संक्रमण के दौरान मूत्र मार्ग में सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के कारण, हम polymorphonuclear ल्युकोसैट की जांच में सक्षम बनाता है कि इन विट्रो परख, transuroepithelial न्युट्रोफिल प्रवास परख, विकसित -8. Transepithelial प्रवास के अन्य दो कक्ष मॉडल के रूप में, सुसंस्कृत मानव मूत्राशय उपकला कोशिकाओं एक पारगम्य समर्थन के नीचे पर वृद्धि हुई है और मिला हुआ उपकला परतों रूप कर रहे हैं. शिरापरक रक्त से अलग मानव neutrophils, उपकला परत की basolateral ओर करने के लिए लागू कर रहे हैं, और physiologically प्रासंगिक basolateral करने वाली शिखर दिशा में उपकला भर में प्रवास ई. के विभिन्न प्रकारों के साथ संक्रमण के जवाब में मात्रा निर्धारित है कोली या chemoattractant अणुओं की उपस्थिति. अधिक से अधिक शोध अतिरिक्त प्रकार की कोशिकाओं के अभाव में, न्युट्रोफिल आंदोलन पर किसी रासायनिक पदार्थ द्वारा किसी जीव की क्रियाशीलता का बढ़ जाना और chemotaxis दोनों ध्यान केंद्रित किया था. यह खाते में संक्रमण के दौरान मूत्राशय उपकला कोशिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच जटिल संबंधों के रूप में लेता transuroepithelial न्युट्रोफिल प्रवास परख फायदेमंद है. इस विनयशील में इन विट्रो मॉडल uroepithelial सतहों पर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की विस्तृत जांच की अनुमति की क्षमता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
एक सुसंस्कृत मूत्राशय उपकला कोशिका लाइन और हौसले से अलग मानव PMN का उपयोग करना, हम transuroepithelial न्युट्रोफिल प्रवास के इन विट्रो मॉडल की स्थापना की. इस मॉडल मूत्र मार्ग के संक्रमण (यूटीआई) के दौरान सहज प्रति?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के स्वास्थ्य (NIH) के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया R01-DK080752 और P50-DK064540 अनुदान. हम इस परख की स्थापना में उनके प्रयासों के लिए जे Loughman धन्यवाद.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Transwell Inserts (i.e. permeable supports) | Corning | 3472 | 6.5 mm, 3 μm pore, polyester membrane insert |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes | Becton, Dickinson and Company (BD) | 366480 | 16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin |
| BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set | Becton, Dickinson and Company (BD) | 367281 | 21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing |
| BD Vacutainer one-use, nonstackable holder | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364815 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | From Leuconostoc mesenteroides |
| Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Ultra-Low Attachment Plates | Corning | 3473 | 24-well, clear flat bottom |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) | Sigma-Aldrich | F3506 | Reconstituted in DMSO to 10 mM |
| Recombinant Human CXCL8/IL-8 | R&D Systems | 208-IL | Reconstituted in PBS to 100 μg/ml |
References
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