مهدها الخميرة استخراج البروتين وتنقية لدراسة وظيفة، والتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية
Summary
إعداد جودة عالية مقتطفات خلية الخميرة هو خطوة أولى ضرورية في تحليل البروتينات الفردية أو proteomes بأكمله. نحن هنا وصف بروتوكول التجانس سريعة وفعالة، وموثوقة لخلايا الخميرة في مهدها الذي تم الأمثل للحفاظ على وظائف البروتين، وتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية.
Abstract
التجانس بالضرب حبة هو وسيلة سريعة وفعالة لإطلاق سراح DNA، RNA، البروتينات، ونواتج الأيض من خلايا الخميرة في مهدها، والتي من الصعب بمكان أن يتم تعطيل. نحن هنا وصف استخدام الخالط طاحونة حبة لاستخراج البروتينات في مخازن الأمثل للحفاظ على وظائف، والتفاعلات والتعديلات بعد متعدية من البروتينات. تزرع الخلايا المتنامية غاريثمي التعبير عن بروتين من الفائدة في وسائط النمو السائل في الاختيار. يمكن استكمال وسائل الاعلام النمو مع الكواشف للحث على التعبير البروتين من المروجين محرض (مثل اللبن)، وتزامن مرحلة دورة الخلية (مثل نوكودازول)، أو تثبيط وظيفة proteasome و(على سبيل المثال MG132). الخلايا ثم مكعبات ومعلق في منطقة عازلة مناسبة تحتوي على الأنزيم البروتيني و / أو مثبطات إنزيم الفوسفاتيز وإما معالجتها فورا أو تجميدها في النيتروجين السائل لاستخدامها لاحقا. ويتم إنجاز تجانس من قبل ست دورات من 20 ثانية BEAD-الضرب (5.5 متر / ثانية)، تليها كل واحد الحضانة دقيقة على الجليد. يتم مسح جناسة الناتجة بواسطة الطرد المركزي، ويمكن إزالتها عن طريق الترشيح الجسيمات الصغيرة. وعجلت الناتجة تطهيرها استخراج خلية كاملة (WCE) باستخدام 20٪ TCA للتحليل المباشر من مجموع البروتينات بواسطة SDS-PAGE تليها الغربية النشاف. مقتطفات هي أيضا مناسبة لتنقية تقارب من بروتينات معينة، والكشف عن التعديلات بعد متعدية، أو تحليل البروتينات شارك في تنقية. كما هو الحال بالنسبة لمعظم بروتوكولات تنقية البروتين، قد تكون بعض الانزيمات والبروتينات تتطلب الظروف الفريدة أو التراكيب العازلة لتنقية والبعض الآخر قد يكون غير مستقر أو غير قابل للذوبان في إطار الشروط المنصوص عليها. في الحالة الأخيرة، يجوز للبروتوكول المعروضة توفير نقطة انطلاق مفيدة لتحديد تجريبيا أفضل استراتيجية حبة الضرب لاستخراج البروتين وتنقية. نقدم لك مجموعة من استخراج وتنقية حاتمة الموسومة السومو E3 يغاز، Siz1، دورة الخليةتنظم البروتين الذي يصبح كلا sumoylated وفسفرته، فضلا عن السومو استهداف اليوبيكويتين الوحيدات يغاز، Slx5.
Introduction
قوة رهيبة من الخميرة علم الوراثة هو الأسطوري، ولكن إعداد وتحليل البروتينات الأم من الخميرة في مهدها، خميرة الخباز، غالبا ما يكون محفوفا بالمشاكل. ويرجع ذلك إلى قوة ميكانيكية كبيرة ومرونة جدار خلية الخميرة 1 هذا الأخير. وقد وصفت وسائل مختلفة لالأنزيمية والكيميائية والميكانيكية، والقائم على الضغط تعطيل خلايا الخميرة للحصول على مستخلص بروتين كامل الخلية 2-6. هذه التقنيات تختلف على نطاق واسع في فعاليتها لانتاج الخلايا ممثل وعصائر البروتين الأصلية التي يمكن استخدامها لتحليلات لاحقة أو خطوات تنقية. على سبيل المثال، يمكن إزالة جدار خلية الخميرة مع الانزيمات التحللي (على سبيل المثال zymolyase) والناتجة spheroblasts يمكن أن تتعطل عن طريق القص والمنظفات، أو تحلل التناضحي للافراج عن البروتينات. واستخدمت هذه الطريقة بنجاح كنقطة انطلاق لكثير من fractionations التحت خلوية ولكنه يتطلب حضانات مطولةغير متوافقة مع استقرار بعض البروتينات 7.
الملكية الكواشف تحلل الخميرة (مثل المنظفات) لاستخراج المواد الكيميائية للبروتينات من خلايا الخميرة متاحة تجاريا ولكن فعالية هذه الكواشف في استخراج البروتين وتأثيرها على توصيف البيوكيميائية لاحقة من البروتينات ليست دائما واضحة 8. المجانسة ارتفاع الضغط، وغالبا ما يشار الى المطابع الفرنسية، وكسر على نحو فعال خلايا الخميرة عن طريق إخضاع الأول لهم لضغط عال ومن ثم ينبثق منها من خلال فتحة صغيرة في خلية الضغط. هذه التقنية تنتج مقتطفات جودة عالية ولكن معدات مكلفة للغاية، وربما لا تكون مناسبة لكميات صغيرة من الخلايا أو عينات متعددة 9. ولذلك، تعطل ميكانيكي لخلايا الخميرة في طاحونة حبة وغالبا ما يكون الأسلوب المفضل لأصلي الاستعدادات بروتين الخميرة 10. هذا الأسلوب الذي ينطوي على اضطراب الميكانيكية للجدار خلية الخميرة مع حمض واتسليط الخرز الزجاجي، والتي يمكن أن تتم مع مجموعة متنوعة من الهزازات، vortexers أو المطاحن حبة. والجدير بالذكر أن هذه الطريقة يمكن استخدامها في وقت واحد لمعالجة عدة عينات أصغر (1 مل من الخلايا أو أقل). العديد من حبات مختلفة أو حبة مصفوفات اضطراب مطحنة هي الآن متاحة تجاريا لتعطيل أي تقريبا نوع من نوع من الخلايا في أنابيب 2 مل. النظر في التقنيات والمعدات الأخرى، طاحونة حبة لديه ميزة إضافية أن تعطل من خلايا الخميرة يحدث سريع جدا، مما يساعد على الحفاظ على التعديلات بعد متعدية مثل sumoylation، وخصوصا عندما تستخدم المخازن المؤقتة المناسبة مع الأنزيم البروتيني و / أو مثبطات proteasome و ويتم التحكم في درجة الحرارة من مقتطفات.
ويركز هذا البروتوكول على استخراج سريع، فعال، وموثوق بها من البروتينات الذاتية والإفراط في المعبر عنه في ظروف لطيف مع الهدف النهائي المتمثل في الحفاظ على وظيفة البروتين، وتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية. وسائط النمو، العازلة تحلل الخليةيتم تحسين التراكيب، وإعدادات طاحونة حبة للحفاظ على تفاعلات البروتين والتعديلات بعد متعدية مثل sumoylation وubiquitylation.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويركز هذا البروتوكول على إعداد سليمة، والأم، وتعديلها بعد translationally البروتينات من خلايا الخميرة في مهدها لتطبيقات أسفل تيار. قبل محاولة هذا البروتوكول، فمن الأهمية بمكان لتحديد ما إذا كان البروتين من الفائدة يمكن أن يتم الكشف عن البروتين بسهولة في مقتطفات أعدت في ظل …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر جميع أعضاء المختبر Kerscher لدعمهم. نشكر كافة Hochstrasser للخميرة سلالة MHY3765. وأيد هذا العمل من قبل جبهة الخلاص الوطني منحة 1051970 (إلى OK) ومعهد هوارد هيوز الطبي الجامعية منحة السفر ومونرو علماء برنامج منح (لES).
Materials
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Yeast ORF strain in BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction |
| pYES2.1 TOPO vector | Life Technologies | K4150-01 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap | BioExpress | C-3369-3 | Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8161 | Use for additional filtering of clarified lysate |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | For the purification of 6xHIS tagged proteins |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Life Technologies | NP0321BOX | Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Protein gel stain |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | Alternative commercial lysis buffer |
| Anti-V5 agarose | Sigma | A7345 | Method of immunoprecipitation |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS gels | Life Technologies | NP0321BOX | |
| anti-myc antibody | Covance | mms-150R | |
| secondary antibody | Abcam | ab97040 | Goat pAb to mouse IgG (HRP) |
References
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae. Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).
- Gelperin, D. M., White, M. A., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).
- Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein. J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Hannich, J. T., Lewis, A., et al. Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).
- Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).
- Daum, G. G., Böhni, P. C. P., Schatz, G. G. Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria. J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).
- Deutscher, M. P. . Guide to protein purification. , (1990).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid. EMBO J. 7 (7), 2233 (1988).
- Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion. Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).
- Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway. Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).
- Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1. BMC Biol. 9, 74 (2011).
- Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation. J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).
