Spirende Gær Protein ekstraktion og oprensning for Studiet af Function, Interactions og post-translationelle modifikationer
Summary
Udarbejdelsen af høj kvalitet gær celleekstrakter er et nødvendigt første skridt i analysen af de enkelte proteiner eller hele proteomer. Her beskriver vi en hurtig, effektiv og pålidelig homogenisering protokol for spirende gærceller, der er blevet optimeret til at bevare protein funktioner, interaktioner og post-translationelle modifikationer.
Abstract
Homogenisering af perle slag er en hurtig og effektiv måde at frigive DNA, RNA, proteiner og metabolitter fra spirende gærceller, som er notorisk svære at forstyrre. Her beskriver vi anvendelsen af en kuglemølle homogenisator til udvinding af proteiner i buffere optimeret til at opretholde de funktioner, interaktioner og post-translationelle modifikationer af proteiner. Logaritmisk voksende celler, der udtrykker proteinet af interesse dyrkes i et flydende vækstmedium af valg. Vækstmedierne kan suppleres med reagenser til at inducere proteinekspression fra inducerbare promotorer (fx galactose), synkronisere cellecyklus fase (f.eks nocodazol), eller inhibere proteasom funktion (f.eks MG132). Celler er pelleteres derefter og resuspenderes i en egnet puffer indeholdende protease og / eller phosphataseinhibitorer og enten forarbejdes straks eller frosset i flydende nitrogen til senere brug. Homogenisering opnås ved seks cyklusser af 20 sek bead-slå (5,5 m / sek), hver efterfulgt af et minutters inkubering på is. Den resulterende homogenat klaret ved centrifugering og små partikler kan fjernes ved filtrering. Den resulterende blokerede hele celleekstrakt (WCE) udfældes med 20% TCA til direkte analyse af totale proteiner ved SDS-PAGE efterfulgt af Western blotting. Ekstrakter er også egnet til affinitetsoprensning af specifikke proteiner, påvisning af post-translationelle modifikationer, eller analyse af co-rensende proteiner. Som det er tilfældet for de fleste proteinoprensningsmetoder protokoller, kan nogle enzymer og proteiner kræver unikke betingelser eller puffersammensætninger for deres rensning og andre kan være ustabil eller uopløselig under de angivne betingelser. I sidstnævnte tilfælde kan det fremlagte protokol giver et nyttigt udgangspunkt for empirisk bestemme den bedste perle-bankende strategi for protein ekstraktion og oprensning. Vi viser udvinding og oprensning af en epitop-tagget SUMO E3 ligase, Siz1, en cellecyklusreguleret protein, der både bliver sumoylated og phosphoryleret, samt en SUMO målrettet ubiquitinligase subunit Slx5.
Introduction
Den overvældende strøm af gær genetik er legendarisk, men forberedelse og analyse af native proteiner fra spirende gær, Saccharomyces cerevisiae, er ofte fyldt med problemer. Sidstnævnte skyldes den betydelige mekanisk styrke og elasticitet af gærcellevæggen 1.. Forskellige midler er blevet beskrevet til enzymatisk, kemisk, mekanisk og trykbaseret afbrydelse af gærceller at opnå helcelle proteinekstrakt 2-6. Disse teknikker varierer meget i deres effektivitet til at give celle-repræsentative, indfødte proteinekstrakter, der kan bruges til efterfølgende analyser eller oprensningstrin. For eksempel kan gærcellevæggen fjernes med lytiske enzymer (f.eks Zymolyase) og deraf spheroblasts kan forstyrres af forskydning, rengøringsmidler eller osmotisk lysis at frigive proteiner. Denne fremgangsmåde er med held blevet anvendt som udgangspunkt for mange subcellulære fraktioneringer men det kræver langvarige inkubationerder ikke er forenelige med stabiliteten af nogle proteiner 7.
Farmaceutiske gær lysis reagenser (såsom detergenter) for kemisk ekstraktion af proteiner af gærceller er kommercielt tilgængelig, men effekten af disse reagenser i proteinekstraktion og deres virkning på efterfølgende biokemisk karakterisering af proteiner er ikke altid klart 8. Højt tryk homogenisatorer, der ofte omtales som franske presser, effektivt bryde gærceller ved først at udsætte dem for højt tryk og derefter ekstrudere dem gennem en lille åbning i en trykcelle. Denne teknik producerer høj kvalitet ekstrakter men udstyret er meget dyrt og kan ikke være egnet til små mængder af celler eller flere prøver 9. Derfor, mekanisk afbrydelse af gærceller i en kuglemølle er ofte den foretrukne metode til native gær proteinpræparater 10. Denne teknik indebærer mekanisk forstyrrelse af gærcellevæggen med syre-wakaste glasperler, som kan udføres med en række forskellige rystere, vortexers eller perle møller. Især kan denne fremgangsmåde anvendes til samtidigt behandle flere mindre prøver (1 ml celler eller mindre). Mange forskellige perler eller kuglemølle disruption matricer er nu kommercielt tilgængelige at forstyrre næsten enhver form for celletype i 2 ml rør. Betragtning af de andre teknikker og udstyr, en kuglemølle har den fordel, at afbrydelsen af gærceller sker meget hurtigt, hvilket bidrager til at bevare posttranslationelle modifikationer såsom sumoylation, især når de relevante buffere med protease og / eller proteasomhæmmere udnyttes og temperaturen af ekstrakter styres.
Denne protokol fokuserer på hurtig, effektiv og pålidelig udvinding af endogene og over-udtrykte proteiner under blide forhold med det ultimative mål at bevare protein funktion, interaktioner, og post-translationelle modifikationer. Vækstmedier, cellelyse bufferkompositioner og perlemølle indstillinger er optimeret til at bevare protein interaktioner og post-translationelle modifikationer såsom sumoylation og ubiquitylering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol fokuserer på forberedelsen af intakt, indfødte og posttranslationelt modificerede proteiner fra spirende gærceller for down-stream-applikationer. Inden du forsøger denne protokol er det afgørende at fastslå, om proteinet af interesse kan let påvises i proteinekstrakter udarbejdet under denaturerende betingelser 12.. Hvis polyklonale antistoffer ikke er tilgængelige, kan det være fordelagtigt at epitopmærke proteinet af interesse, således at fusionsproteinet kan detekteres på W…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker alle medlemmer af Kerscher laboratorium for deres støtte. Vi takker Mark Hochstrasser for gærstamme MHY3765. Dette arbejde blev støttet af NSF tilskud 1051970 (til OK) og en Howard Hughes Medical Institute Undergraduate Rejselegat og Monroe Scholars Program Grant (ES).
Materials
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Yeast ORF strain in BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction |
| pYES2.1 TOPO vector | Life Technologies | K4150-01 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap | BioExpress | C-3369-3 | Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8161 | Use for additional filtering of clarified lysate |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | For the purification of 6xHIS tagged proteins |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Life Technologies | NP0321BOX | Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Protein gel stain |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | Alternative commercial lysis buffer |
| Anti-V5 agarose | Sigma | A7345 | Method of immunoprecipitation |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS gels | Life Technologies | NP0321BOX | |
| anti-myc antibody | Covance | mms-150R | |
| secondary antibody | Abcam | ab97040 | Goat pAb to mouse IgG (HRP) |
References
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae. Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).
- Gelperin, D. M., White, M. A., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).
- Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein. J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Hannich, J. T., Lewis, A., et al. Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).
- Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).
- Daum, G. G., Böhni, P. C. P., Schatz, G. G. Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria. J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).
- Deutscher, M. P. . Guide to protein purification. , (1990).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid. EMBO J. 7 (7), 2233 (1988).
- Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion. Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).
- Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway. Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).
- Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1. BMC Biol. 9, 74 (2011).
- Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation. J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).
