Многообещающая Добыча дрожжевого белка и очистка по изучению функций, взаимодействия и пост-трансляционных модификаций
Summary
Подготовка высокого качества дрожжевых экстрактов клетка является необходимым первым шагом в анализе отдельных белков или целых протеомов. Здесь мы опишем быстрый, эффективный и надежный протокол для гомогенизации перспективных дрожжевых клеток, которая была оптимизирована для сохранения функции белков, взаимодействия и пост-трансляционных модификаций.
Abstract
Гомогенизации шарик избиение быстрый и эффективный способ, чтобы освободить ДНК, РНК, белков и метаболитов из перспективных дрожжевых клеток, которые, как известно, трудно нарушить. Здесь мы описываем использование шарикового гомогенизатора мельница для извлечения белков в буферы оптимизированы для поддержания функций, взаимодействия и посттрансляционных модификаций белков. Логарифмически растущие клетки, экспрессирующие белок выращивают в жидкой питательной среды выбора. Питательной среды может быть дополнен реагентов для индукции экспрессии белка от индуцируемые промоторы (например, галактозы), синхронизировать стадии клеточного цикла (например, нокодазолом) или ингибирует протеасомы функции (например, MG132). Затем клетки осаждали и ресуспендировали в подходящем буфере, содержащем протеазу и / или ингибиторы фосфатазы и обрабатывалась непосредственно или замораживали в жидком азоте для последующего использования. Гомогенизация осуществляется посредством шести циклов по 20 сек BEAг избиение (5,5 м / с), каждым из которых следует один минут инкубации на льду. В результате гомогенат осветляли центрифугированием и малые частицы могут быть удалены путем фильтрации. Полученное очищен весь клеточный экстракт (WCE) осаждают с использованием 20% ТСА для прямого анализа общего белка в ДСН-ПААГ с последующим Вестерн-блоттингом. Экстракты также пригодны для аффинной очистки специфических белков, обнаружение посттрансляционной модификации или анализа совместного очистки белков. Как и в случае большинства протоколов очистки белка, некоторых ферментов и белков может потребовать уникальных условий или буфер композиций для их очистки и другие может быть нестабильным или нерастворимыми в условиях указано. В последнем случае, протокол, представленные может стать полезной отправной точкой для эмпирически определить лучших шарик избиение стратегии для извлечения и очистки белков. Мы покажем, добыче и очистке Эпитоп-меченый SUMO E3 лигазы, Siz1, клеточный циклрегулируется белком, который становится одновременно и SUMOylated фосфорилированному, а также SUMO-целевых убиквитином субъединицы лигазы, Slx5.
Introduction
Огромная сила дрожжей генетики является легендарным, но подготовка и анализ нативных белков от почкующихся дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE, часто сопряжено с проблемами. Последнее обусловлено значительной механической прочностью и эластичностью дрожжевой клеточной стенки 1. Различные средства были описаны ферментативные, химические, механические и на основе давления разрушение клеток дрожжей для получения цельноклеточной белкового экстракта 2-6. Эти методы различаются по их эффективности для получения клеточного представителя, родной экстракты белка, который может быть использован для последующего анализа или очистки. Например, стена дрожжевой клетки могут быть удалены с литических ферментов (например, зимолиазой), и в результате spheroblasts может быть нарушена сдвига, моющие средства, или осмотический лизис освободить белков. Этот подход был успешно использован в качестве отправной точкой для многих субклеточном фракционирования но это требует длительной инкубации, которые не совместимы со стабильностью некоторые белки 7.
Собственные лизису дрожжей реагентов (например, моющих средств) для химической экстракции белков клеток дрожжей являются коммерчески доступными, но эффективность этих реагентов в экстракции белков и их влияние на последующее биохимическая характеристика белков не всегда ясно, 8. Гомогенизаторов высокого давления, часто упоминается как французский пресс, эффективно разрушить дрожжевые клетки, сначала подвергать их воздействию высокого давления, а затем их экструзии через небольшое отверстие в напорной камере. Этот метод обеспечивает высокое качество экстрактов но оборудование очень дорого и не могут быть пригодны для небольшого количества клеток или несколько образцов 9. Таким образом, механическое разрушение клеток дрожжей в шаровой мельнице часто методом выбора для родных дрожжей белковых препаратов 10. Этот метод включает механическое разрушение клеточной стенки дрожжей с кислотно-вапролить стеклянные шарики, которые могут быть проведены с различными шейкеры, vortexers или шаровых мельниц. Следует отметить, что этот метод может использоваться, чтобы одновременно обрабатывать множество меньших образцов (1 мл клеток или меньше). Много различных бусин или бисера матриц нарушения мельница теперь коммерчески доступных сорвать практически любой тип клеток в 2 мл пробирок. С учетом других методов и оборудования, шаровой мельнице имеет дополнительное преимущество, что разрушение клеток дрожжей происходит очень быстро, что помогает сохранить посттрансляционных модификаций, таких как сумоилирование, особенно когда соответствующие буферы с протеазы и / или ингибиторы протеасом используются и температура выдержки контролируется.
Этот протокол фокусируется на быстрое, эффективное и надежное извлечение эндогенных и сверхэкспрессированные белками в мягких условиях с конечной целью сохранения функции белка, взаимодействия и пост-трансляционных модификаций. Рост средств массовой информации, буфер лизиса клетоккомпозиции и настройки стана шарика оптимизированы для поддержания белковых взаимодействий и пост-трансляционных модификаций, таких как SUMOylation и убиквитилированию.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол сосредоточен на подготовке нетронутыми, родной, и после трансляции модифицированных белков из перспективных дрожжевых клеток для вниз по течению приложений. Перед этим протоколом, очень важно, чтобы определить, если интересующего белка могут быть легко обнаружены в экс?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим всех членов Kerscher лаборатории за их поддержку. Мы благодарим Марка Хохштрассер для штамма дрожжей MHY3765. Эта работа была поддержана грантом NSF 1051970 (в порядке), и Медицинского института Говарда Хьюза Бакалавриат Путешествия грантов и Монро Ученые программы Грант (Е. С.).
Materials
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | |
| Yeast ORF strain in BG1805 | ThermoScientific | YSC3869 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction |
| pYES2.1 TOPO vector | Life Technologies | K4150-01 | GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x) | Thermo Scientific | 1860932 | |
| 2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap | BioExpress | C-3369-3 | Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm (30-40 US sieve) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8161 | Use for additional filtering of clarified lysate |
| TALON Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | For the purification of 6xHIS tagged proteins |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | NP0007 | To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Life Technologies | NP0321BOX | Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting |
| Simply Blue | Life Technologies | #LC6060 | Protein gel stain |
| Mammalian Lysis Buffer | Promega | G9381 | Alternative commercial lysis buffer |
| Anti-V5 agarose | Sigma | A7345 | Method of immunoprecipitation |
| ECL | Millipore | WBKL S0 050 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| BIS-TRIS gels | Life Technologies | NP0321BOX | |
| anti-myc antibody | Covance | mms-150R | |
| secondary antibody | Abcam | ab97040 | Goat pAb to mouse IgG (HRP) |
References
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae. Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).
- Gelperin, D. M., White, M. A., et al. Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection. Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).
- Caserta, E., Haemig, H. A. H., et al. In Vivo and In Vitro Analyses of Regulation of the Pheromone-Responsive prgQ Promoter by the PrgX Pheromone Receptor Protein. J. Bacteriol. 194 (13), 3386-3394 (2012).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Hannich, J. T., Lewis, A., et al. Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).
- Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor. Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).
- Daum, G. G., Böhni, P. C. P., Schatz, G. G. Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria. J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).
- Deutscher, M. P. . Guide to protein purification. , (1990).
- Puig, O., Caspary, F., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Conzelmann, A., Riezman, H., Desponds, C., Bron, C. A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid. EMBO J. 7 (7), 2233 (1988).
- Dertzbaugh, M. T. M., Cox, L. M. L. The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion. Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).
- Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway. Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).
- Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1. BMC Biol. 9, 74 (2011).
- Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation. J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).
