Subretinal transplantation av MACS renad fotoreceptor prekursor celler i den vuxna mus näthinnan
Summary
Celltransplantation representerar en strategi för behandling av retinal degeneration kännetecknas av photoreceptor förlust. Här beskriver vi en metod för berikning av transplanterbara fotoreceptorer och deras subretinal ympning i vuxna möss.
Abstract
Synnedsättning och blindhet på grund av förlusten av näthinnans ljusavkännande celler, dvs. fotoreceptorer, utgör den främsta orsaken till funktionshinder i industrialiserade länder. Ersättning av degenererade fotoreceptorer genom celltransplantation representerar ett möjligt behandlingsalternativ i framtida kliniska tillämpningar. Nyligen genomförda prekliniska studier visade faktiskt att omogna fotoreceptorer, isolerade från neonatalmus näthinnan vid postnatal dag 4, har potential att integreras i den vuxna mus näthinnan efter subretinal transplantation. Donatorceller genererade en mogen fotoreceptormorfologi inklusive inre och yttre segment, en rund cellkropp belägen vid det yttre kärnskiktet och synaptiska terminaler i närheten av endogena bipolära celler. Faktum är att de senaste rapporterna visade att donatorfotoreceptorer funktionellt integreras i de neurala kretsarna hos värdmöss. För en framtida klinisk tillämpning av en sådan cellersättningsmetod måste rena suspensioner av de celler som väljer genereras och placeras i rätt position för korrekt integration i ögat. För berikning av photoreceptor prekursorer bör sortering baseras på specifika cellytans antigener för att undvika genetisk reporter modifiering av donatorceller. Här visar vi magnetiskt associerad cellsortering (MACS) – berikning av transplanterbara stångfotoreceptorprekursorer isolerade från neonatal näthinnan hos fotoreceptorspecifika reportermöss baserade på cellytans markör CD73. Inkubation med anti-CD73 antikroppar följt av mikro-pärla konjugerade sekundära antikroppar tillät anrikning av stång photoreceptor prekursorer av MACS till cirka 90%. I jämförelse med flödescytometri har MACS fördelen att det kan vara lättare att tillämpa på GMP-standarder och att stora mängder celler kan sorteras under relativt korta tidsperioder. Injektion av berikade cell suspensioner i subretinal utrymmet hos vuxna vilda möss resulterade i en 3-faldig högre integrationshastighet jämfört med osorterade cell suspensioner.
Introduction
Vision är en av människans främsta sinnen. Försämring av denna känsla och blindhet är en av de främsta orsakerna till funktionshinder i industrialiserade länder. Den dominerande orsaken till synnedsättning eller blindhet är retinal degeneration, kännetecknad av fotoreceptor cellförlust, eftersom det kan observeras i makuladegeneration, retinitis pigmentosa, kon-rod dystrofi och andra villkor. Hittills är en effektiv terapi för att återställa förlorad syn inte tillgänglig. Under 2006 och 2008 rapporterade två olika laboratorier, oberoende av varandra, en framgångsrik transplantation av stavfotoreceptorprekursorceller till vuxna vilda möss näthinnorna1,2. Således uppstår möjligheten av photoreceptor föregångare celltransplantation också i en degenererad näthinnan, att ersätta urartade fotoreceptorer och återställa vision. Det har faktiskt nyligen visats att sådana transplanterade fotoreceptorprekursorceller framkallar morfologiska kriterier för mogna fotoreceptorer av vildtyp, såsom korrekt utvecklade yttre segment3, synaptiska terminaler i närheten av endogena bipolära celler och en rund cellkropp belägen i det yttrekärnskiktet 2-4, liksom förmågan att integrera funktionellt i värden neurala kretsar5-7. En av huvudprinciperna i denna strategi är användningen av postnatal dag 4 (PN 4, PN0 definieras som födelsedag) unga möss näthinnorna, vilket resulterar i en blandning av olika celltyper för transplantation. På bakgrunden av en framtida terapeutisk tillämpning måste denna blandning renas för fotoreceptorprekursorceller. CD73 har beskrivits som den första cellytan markör specifik för unga fotoreceptorer i näthinnan8-10. Här demonstrerar vi en photoreceptor prekursor cell rening metod baserat på denna cell yta markör och med användning av den magnetiskt associerade cell sortering (MACS) tekniken. MACS kan ha fördelar jämfört med fluorescerande aktiverade cellsorteringstekniker, på grund av snabba sorteringstider och enklare justering av GMP-förhållanden. Vi kunde visa en ~ 90% berikning och en upp till 3-faldig högre integrationshastighet vid transplantation av den berikade befolkningen till subretinalutrymmet i vuxna vilda näthinner. Således är MACS-baserade photoreceptor föregångare cellberikning och subretinal transplantation, tillförlitliga och lovande tekniker för utveckling av en regenerativ terapeutisk strategi för behandling av retinal degeneration.
Protocol
Representative Results
Discussion
Subretinal transplantation av photoreceptor prekursor celler representerar ett tillförlitligt verktyg för att uppnå integration av dessa ljuskänsliga celler i värd näthinnan i betydande antal1,2. Detta kan göra det möjligt att inrätta en cellterapi för behandling av retinal degenerativa sjukdomar i framtiden6. Donatorpopulationen av celler, för närvarande isolerad från PN 4 näthinnan, är en blandning av olika celltyper, från vilken endast photoreceptor prekursorceller integreras efter subretinal injektio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Anand Swaroop för att ha tillhandahållit Nrl-GFP-möss, Jochen Haas för teknisk support och Sindy Böhme och Emely Lessmann för djurhållning.
Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 – Center of Regenerative Therapies Dresden, CRTD Seed Grant Program, SFB 655 och ProRetina e.V. digs-BB Graduate Program Dresden och Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)
Materials
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | supplied DNase I is not used in the method |
| purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stock concentration 0.5mg/ml |
| Goat Anti-Rat IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Total volume of 2ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to count the total number of cells |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | – |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Used for dissociation of the retinas |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Used to count the total number of cells |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | – | – |
| Domitor | Pfizer | 76579 | – |
| Ketamin 10% | Ratiopharm | 7538843 | – |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | – |
| Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% | University clinics Dresden pharmacy | – | – |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | – |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | – |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | – |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | – |
| fire polish glass pasteur pipette | Brand | 74777 20 | The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved. |
| MACS 15ml tube rack | Miltenyi | 130-091-052 | – |
| Cell count chamber | Carl Roth | T728.1 | – |
| Sterile 15ml tubes | Greiner Bio-one | 188271 | – |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | can be used instead of Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | can be used instead of Leica M651 MSD |
| Olympus inverted stereo microscope CKX41 | Olympus | CKX41 | – |
| Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo scientific | 51025411 | – |
| 1.5ml reaction tube | Sarstedt | 727706400 | – |
| 2ml reaction tube | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Centrifuge 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | – |
| Mouse head holder | myNeurolab | 471030 | – |
| BD Microlance 3 30G 1/2” | BD Pharmingen | 304000 | – |
| Hamilton microliter syringe 5µl, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | delivered without needles |
| Hamilton RN special needle GA34 | Hamilton | 065-207434 | Blunt, 12mm length |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – 5mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15003-08 | – |
| Dumont #7 Forceps – Titanium Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | – |
| Diamond pen | Tools-tech | – | – |
| 15x15mm Cover slips | Sparks | MIC3366 | – |
References
- Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444, 203-207 (2006).
- Eberle, D., et al. Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells. PLoS One. 7, (2012).
- Lakowski, J., et al. Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells. Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).
- Barber, A. C., et al. Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).
- Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. , (2012).
- Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).
- Koso, H., et al. CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).
- Lakowski, J., et al. Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression. Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).
- Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
- Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).
