Subretinale Transplantation von MACS gereinigten Photorezeptor-Vorläuferzellen in die adulte Maus-Retina
Summary
Die Zelltransplantation stellt eine Strategie zur Behandlung der Netzhautdegeneration dar, die durch Photorezeptorverlust gekennzeichnet ist. Hier beschreiben wir eine Methode zur Anreicherung von transplantierbaren Photorezeptoren und deren subretinaler Transplantation in erwachsene Mäuse.
Abstract
Sehstörungen und Erblindung durch den Verlust der lichtempfindlichen Zellen der Netzhaut, d.h. Photorezeptoren, stellen den Hauptgrund für behinderungen in Industrieländern dar. Der Ersatz degenerierter Photorezeptoren durch Zelltransplantation stellt eine mögliche Behandlungsoption in zukünftigen klinischen Anwendungen dar. Tatsächlich haben jüngste präklinische Studien gezeigt, dass unreife Photorezeptoren, die am 4. Tag der Neugeborenen mausisoliert wurden, das Potenzial haben, sich nach subretinaler Transplantation in die netzretinale Netzhaut der erwachsenen Maus zu integrieren. Spenderzellen erzeugten eine ausgereifte Photorezeptormorphologie mit inneren und äußeren Segmenten, einem runden Zellkörper an der äußeren Kernschicht und synaptischen Terminals in unmittelbarer Nähe zu endogenen bipolaren Zellen. Tatsächlich haben jüngste Berichte gezeigt, dass Spenderphotorezeptoren sich funktionell in die neuronalen Schaltkreise von Wirtsmäusen integrieren. Für eine zukünftige klinische Anwendung eines solchen Zellersatzansatzes müssen gereinigte Suspensionen der Zellen der Wahl erzeugt und an die richtige Position für eine ordnungsgemäße Integration in das Auge gebracht werden. Für die Anreicherung von Photorezeptor-Vorläufern sollte die Sortierung auf bestimmten Zelloberflächenantigenen basieren, um eine genetische Reporterveränderung von Spenderzellen zu vermeiden. Hier zeigen wir magnetisch-assoziierte Zellsortierung (MACS) – Anreicherung von transplantierbaren Stabphotorezeptor-Vorläufern, die aus der neonatalen Netzhaut von photorezeptorspezifischen Reportermäusen auf Basis des Zelloberflächenmarkers CD73 isoliert sind. Die Inkubation mit Anti-CD73-Antikörpern gefolgt von mikro-bead-konjugierten sekundären Antikörpern ermöglichte die Anreicherung von Rod-Photorezeptor-Vorläufern durch MACS auf ca. 90%. Im Vergleich zur Durchflusszytometrie hat MACS den Vorteil, dass es einfacher auf GMP-Standards angewendet werden kann und dass große Mengen an Zellen in relativ kurzen Zeiträumen sortiert werden können. Die Injektion angereicherter Zellsuspensionen in den subretinalen Raum erwachsener Wildtypmäuse führte zu einer 3-fach höheren Integrationsrate im Vergleich zu unsortierten Zellsuspensionen.
Introduction
Vision ist einer der wichtigsten Sinne des Menschen. Beeinträchtigung dieses Sinns und Blindheit sind einer der Hauptgründe für Behinderungen in Industrieländern. Die vorherrschende Ursache für Sehbehinderung oder Erblindung ist die Netzhautdegeneration, die durch Photorezeptorzellverlust gekennzeichnet ist, da sie bei Makuladegeneration, Retinitis pigmentosa, Kegelstabdystrophie und anderen Bedingungen beobachtet werden kann. Bis heute ist eine wirksame Therapie zur Wiederherstellung des verlorenen Sehvermögens nicht verfügbar. In den Jahren 2006 und 2008 berichteten zwei verschiedene Labore unabhängig voneinander über eine erfolgreiche Transplantation von Rod-Photorezeptor-Vorläuferzellen in adulte Wildtyp-Mäuse-Retinas1,2. So entsteht die Möglichkeit der Photorezeptor-Vorläuferzelltransplantation auch in eine degenerierte Netzhaut, um degenerierte Photorezeptoren zu ersetzen und das Sehvermögen wiederherzustellen. Tatsächlich wurde in jüngster Zeit gezeigt, dass solche transplantierten Photorezeptor-Vorläuferzellen morphologische Kriterien von reifen Wildtyp-Photorezeptoren entlocken, wie z. B. richtig entwickelte äußere Segmente3, synaptische Klemmen in unmittelbarer Nähe zu endogenen bipolaren Zellen und einem runden Zellkörper in der äußeren Kernschicht2-4, sowie die Fähigkeit, sich funktional in die neuronale Schaltanlage des Wirts zu integrieren5-7. Eines der Hauptprinzipien dieser Strategie ist die Verwendung von postnatalen Tag 4 (PN 4, PN0 ist definiert als Tag der Geburt) junge Mäuse Netzhaut, was zu einer Mischung von verschiedenen Zelltypen für die Transplantation. Vor dem Hintergrund einer zukünftigen therapeutischen Anwendung muss diese Mischung für Photorezeptor-Vorläuferzellen gereinigt werden. CD73 wurde als erster Zelloberflächenmarker speziell für junge Photorezeptoren in der Netzhaut8-10beschrieben. Hier zeigen wir eine Photorezeptor-Vorläuferzellreinigungsmethode auf Basis dieses Zelloberflächenmarkers und unter Verwendung der magnetisch-assoziierten Zellsortierungstechnik (MACS). MACS könnte aufgrund der schnellen Sortierzeiten und der einfacheren Anpassung an GMP-Bedingungen Vorteile gegenüber fluoreszierend aktivierten Zellsortiertechniken haben. Wir könnten eine Anreicherung von 90 % und eine bis zu dreifach höhere Integrationsrate nachweisen, wenn wir die angereicherte Population in den subretinalen Raum in erwachsenen Wild-Retinas transplantieren. So sind MACS-basierte Photorezeptor-Vorläuferzellanreicherung und subretinale Transplantation zuverlässige und vielversprechende Techniken für die Entwicklung einer regenerativen therapeutischen Strategie zur Behandlung der Netzhautdegeneration.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die subretinale Transplantation von Photorezeptor-Vorläuferzellen stellt ein zuverlässiges Werkzeug dar, um die Integration dieser lichtempfindlichen Zellen in die Wirtsnetzhaut in signifikanten Zahlen1,2zu erreichen. Dies könnte die Etablierung einer Zelltherapie zur Behandlung von netzretinalen degenerativen Erkrankungen in Zukunft ermöglichen6. Die Spenderpopulation von Zellen, die derzeit aus PN 4-Retinas isoliert ist, ist eine Mischung aus verschiedenen Zelltypen, aus der sich nach subretinaler Injektion nur di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Anand Swaroop für die Bereitstellung von Nrl-GFP-Mäusen, Jochen Haas für technische Unterstützung und Sindy Böhme und Emely Lessmann für die Tierhaltung.
Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 – Zentrum für Regenerative Therapien Dresden, dem CRTD Seed Grant Program, dem SFB 655 und dem ProRetina e.V. unterstützt. Stiftung, das DIGS-BB Graduate Program Dresden und die Fundaéo para a Ciéncia e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)
Materials
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | supplied DNase I is not used in the method |
| purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stock concentration 0.5mg/ml |
| Goat Anti-Rat IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Total volume of 2ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to count the total number of cells |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | – |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Used for dissociation of the retinas |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Used to count the total number of cells |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | – | – |
| Domitor | Pfizer | 76579 | – |
| Ketamin 10% | Ratiopharm | 7538843 | – |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | – |
| Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% | University clinics Dresden pharmacy | – | – |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | – |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | – |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | – |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | – |
| fire polish glass pasteur pipette | Brand | 74777 20 | The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved. |
| MACS 15ml tube rack | Miltenyi | 130-091-052 | – |
| Cell count chamber | Carl Roth | T728.1 | – |
| Sterile 15ml tubes | Greiner Bio-one | 188271 | – |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | can be used instead of Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | can be used instead of Leica M651 MSD |
| Olympus inverted stereo microscope CKX41 | Olympus | CKX41 | – |
| Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo scientific | 51025411 | – |
| 1.5ml reaction tube | Sarstedt | 727706400 | – |
| 2ml reaction tube | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Centrifuge 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | – |
| Mouse head holder | myNeurolab | 471030 | – |
| BD Microlance 3 30G 1/2” | BD Pharmingen | 304000 | – |
| Hamilton microliter syringe 5µl, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | delivered without needles |
| Hamilton RN special needle GA34 | Hamilton | 065-207434 | Blunt, 12mm length |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – 5mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15003-08 | – |
| Dumont #7 Forceps – Titanium Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | – |
| Diamond pen | Tools-tech | – | – |
| 15x15mm Cover slips | Sparks | MIC3366 | – |
References
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