Subretinal transplantasjon av MACS Renset Fotoreseptor Forløper Celler i Voksen Mus Retina
Summary
Celletransplantasjon representerer en strategi for behandling av retinal degenerasjon preget av fotoreseptortap. Her beskriver vi en metode for berikelse av transplanterbare fotoreseptorer og deres subretinale podning til voksne mus.
Abstract
Synshemming og blindhet på grunn av tap av de lysfølsomme cellene i netthinnen, det vil si fotoreseptorer, representerer hovedårsaken til funksjonshemming i industrialiserte land. Utskifting av degenererte fotoreseptorer ved celletransplantasjon representerer et mulig behandlingsalternativ i fremtidige kliniske applikasjoner. Faktisk viste nyere prekliniske studier at umodne fotoreseptorer, isolert fra neonatal mus netthinnen på postnatal dag 4, har potensial til å integrere seg i voksenmus netthinnen etter subretinal transplantasjon. Donorceller genererte en moden fotoreseptormorfologi, inkludert indre og ytre segmenter, en rund cellekropp plassert på det ytre kjernefysiske laget, og synaptiske terminaler i nærheten av endogene bipolare celler. Faktisk viste nylige rapporter at donor fotoreseptorer funksjonelt integreres i nevrale kretser av vertsmus. For en fremtidig klinisk anvendelse av en slik celleerstatningstilnærming, må rensede suspensjoner av de valgte cellene genereres og plasseres i riktig posisjon for riktig integrasjon i øyet. For berikelse av fotoreseptorforløpere bør sortering være basert på spesifikke celleoverflateantigener for å unngå genetisk reportermodifisering av donorceller. Her viser vi magnetisk assosiert cellesortering (MACS) – berikelse av transplanterbare stang fotoreseptorforløpere isolert fra neonatal netthinnen til fotoreseptorspesifikke reportermus basert på celleoverflatemarkøren CD73. Inkubasjon med anti-CD73 antistoffer etterfulgt av mikro-perle konjugerte sekundære antistoffer tillot berikelse av stang fotoreseptor forløpere av MACS til ca. 90%. Sammenlignet med strømningscytometri har MACS fordelen at det kan brukes lettere på GMP-standarder, og at høye mengder celler kan sorteres i relativt korte tidsperioder. Injeksjon av berikede cellesuspensjoner i det subretinaale rommet til voksne villtype mus resulterte i en 3 ganger høyere integrasjonshastighet sammenlignet med usorterte cellesuspensjoner.
Introduction
Visjon er en av menneskets viktigste sanser. Svekkelse av denne sansen og blindheten er en av hovedårsakene til funksjonshemming i industrialiserte land. Den dominerende årsaken til synshemming eller blindhet er retinal degenerasjon, preget av fotoreseptorcelletap, da det kan observeres i makuladegenerasjon, retinitis pigmentosa, kegle-stang dystrofi og andre forhold. Til dags dato er en effektiv terapi for å gjenopprette tapt syn ikke tilgjengelig. I 2006 og 2008 rapporterte to forskjellige laboratorier, uavhengig av hverandre, en vellykket transplantasjon av stang fotoreseptor forløperceller til voksne villtype mus netthinner1,2. Dermed oppstår muligheten for fotoreseptor forløper celletransplantasjon også inn i en degenerert netthinne, for å erstatte degenererte fotoreseptorer og gjenopprette syn. Faktisk har det blitt demonstrert nylig, at slike transplanterte fotoreseptorforløperceller fremkaller morfologiske kriterier av modne ville fotoreseptorer, for eksempel riktig utviklede ytre segmenter3, synaptiske terminaler i nærheten av endogene bipolare celler og en rund cellekropp som ligger i det ytre kjernefysiske laget2-4, samt evnen til å integrere funksjonelt i verten nevrale kretser5-7. Et av hovedprinsippene i denne strategien er bruken av postnatal dag 4 (PN 4, PN0 er definert som fødselsdagen) unge mus netthinner, noe som resulterer i en blanding av forskjellige celletyper for transplantasjon. På bakgrunn av en fremtidig terapeutisk applikasjon må denne blandingen renses for fotoreseptorforløperceller. CD73 har blitt beskrevet som den første celleoverflatemarkøren som er spesifikk for unge fotoreseptorer i netthinnen8-10. Her demonstrerer vi en photoreceptor forløper cellerensingsmetode basert på denne celleoverflatemarkøren og ved bruk av den magnetiske tilknyttede cellesorteringsteknikken (MACS). MACS kan ha fordeler sammenlignet med fluorescerende aktiverte cellesorteringsteknikker, på grunn av raske sorteringstider og enklere justering av GMP-forhold. Vi kunne demonstrere en ~ 90% berikelse og en opptil 3 ganger høyere integrasjonsrate når vi transplanterer den berikede befolkningen til subretinalrommet i voksne villtype netthinner. Dermed er MACS-basert fotoreseptorforløper forløpercelleberikelse og subretinal transplantasjon pålitelig og lovende teknikker for utvikling av en regenerativ terapeutisk strategi for behandling av retinal degenerasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Subretinal transplantasjon av fotoreseptorforløperceller representerer et pålitelig verktøy for å oppnå integrasjon av disse lysfølsomme cellene i verts netthinner i betydelige tall1,2. Dette kan tillate etablering av en celleterapi for behandling av retinal degenerative sykdommer i fremtiden6. Donorpopulasjonen av celler, for tiden isolert fra PN 4 netthinner, er en blanding av forskjellige celletyper, hvorfra bare fotoreseptorforløpercellene integreres etter subretinal injeksjon. Ved å bruke CD73-basert MAC-so…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi liker å takke Anand Swaroop for å ha gitt Nrl-GFP mus, Jochen Haas for teknisk støtte, og Sindy Böhme og Emely Lessmann for husdyrhold.
Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 – Center of Regenerative Therapies Dresden, CRTD Seed Grant Program, SFB 655 og ProRetina e.V. stiftelse, DIGS-BB Graduate Program Dresden, og Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)
Materials
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | supplied DNase I is not used in the method |
| purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stock concentration 0.5mg/ml |
| Goat Anti-Rat IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Total volume of 2ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to count the total number of cells |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | – |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Used for dissociation of the retinas |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Used to count the total number of cells |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | – | – |
| Domitor | Pfizer | 76579 | – |
| Ketamin 10% | Ratiopharm | 7538843 | – |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | – |
| Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% | University clinics Dresden pharmacy | – | – |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | – |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | – |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | – |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | – |
| fire polish glass pasteur pipette | Brand | 74777 20 | The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved. |
| MACS 15ml tube rack | Miltenyi | 130-091-052 | – |
| Cell count chamber | Carl Roth | T728.1 | – |
| Sterile 15ml tubes | Greiner Bio-one | 188271 | – |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | can be used instead of Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | can be used instead of Leica M651 MSD |
| Olympus inverted stereo microscope CKX41 | Olympus | CKX41 | – |
| Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo scientific | 51025411 | – |
| 1.5ml reaction tube | Sarstedt | 727706400 | – |
| 2ml reaction tube | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Centrifuge 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | – |
| Mouse head holder | myNeurolab | 471030 | – |
| BD Microlance 3 30G 1/2” | BD Pharmingen | 304000 | – |
| Hamilton microliter syringe 5µl, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | delivered without needles |
| Hamilton RN special needle GA34 | Hamilton | 065-207434 | Blunt, 12mm length |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – 5mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15003-08 | – |
| Dumont #7 Forceps – Titanium Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | – |
| Diamond pen | Tools-tech | – | – |
| 15x15mm Cover slips | Sparks | MIC3366 | – |
References
- Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444, 203-207 (2006).
- Eberle, D., et al. Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells. PLoS One. 7, (2012).
- Lakowski, J., et al. Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells. Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).
- Barber, A. C., et al. Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).
- Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. , (2012).
- Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).
- Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).
- Koso, H., et al. CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).
- Lakowski, J., et al. Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression. Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).
- Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
- Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).
