Trapianto subretinale di cellule precursori del fotorecettore purificato MACS nella retina del topo adulto
Summary
Il trapianto cellulare rappresenta una strategia per il trattamento della degenerazione retinica caratterizzata dalla perdita di fotorecettore. Qui descriviamo un metodo per l’arricchimento dei fotorecettori trapiantabili e il loro innesto subretinale in topi adulti.
Abstract
La compromissione della vista e la cecità dovute alla perdita delle cellule che percepiscono la luce della retina, cioè dei fotorecettori, rappresentano la ragione principale della disabilità nei paesi industrializzati. La sostituzione dei fotorecettori degenerati con il trapianto di cellule rappresenta una possibile opzione di trattamento nelle future applicazioni cliniche. Infatti, recenti studi preclinici hanno dimostrato che i fotorecettori immaturi, isolati dalla retina neonatale del topo al giorno 4 postnatale, hanno il potenziale per integrarsi nella retina del topo adulto dopo il trapianto subretinale. Le cellule donatrici hanno generato una morfologia fotorecettori matura che include segmenti interni ed esterni, un corpo cellulare rotondo situato nello strato nucleare esterno e terminali sinaptici in prossimità delle cellule bipolari endogene. In effetti, recenti rapporti hanno dimostrato che i fotorecettori dei donatori si integrano funzionalmente nei circuiti neurali dei topi ospiti. Per una futura applicazione clinica di tale approccio di sostituzione cellulare, le sospensioni purificate delle cellule scelte devono essere generate e posizionate nella posizione corretta per una corretta integrazione nell’occhio. Per l’arricchimento dei precursori del fotorecettore, lo smistamento dovrebbe basarsi su specifici antigeni di superficie cellulare per evitare la modifica genetica delle cellule donatrici da parte dei reporter. Qui mostriamo lo smistamento cellulare associato al magnetico (MACS) – arricchimento dei precursori del fotorecettore a bastone trapiantabile isolati dalla retina neonatale di topi reporter specifici del fotorecettore basati sul marcatore di superficie cellulare CD73. L’incubazione con anticorpi anti-CD73 seguita da anticorpi secondari coniugati con micro-perline ha permesso l’arricchimento dei precursori del fotorecettore dell’asta da parte del MACS a circa il 90%. Rispetto alla citometria a flusso, MACS ha il vantaggio che può essere più facile da applicare agli standard GMP e che elevate quantità di cellule possono essere ordinate in brevi periodi di tempo relativi. L’iniezione di sospensioni cellulari arricchite nello spazio subretinale dei topi adulti di tipo selvatico ha comportato un tasso di integrazione 3 volte superiore rispetto alle sospensioni cellulari nonsortite.
Introduction
La visione è uno dei sensi primi degli umani. La compromissione di questo senso e della cecità sono una delle principali ragioni della disabilità nei paesi industrializzati. La causa predominante di compromissione della vista o cecità è la degenerazione retinica, caratterizzata da perdita cellulare fotorecettore, in quanto può essere osservata nella degenerazione maculare, retinite pigmentosa, distrofia conica-asta e altre condizioni. Ad oggi, non è disponibile una terapia efficace per ripristinare la visione persa. Nel 2006 e nel 2008 due diversi laboratori hanno riportato, indipendenti l’uno dall’altro, un trapianto riuscito di cellule precursori del fotorecettore di bastone in retine di topi adulti di tiposelvatico 1,2. Così, derivante dalla possibilità di trapianto di cellule precursori del fotorecettore anche in una retina degenerata, per sostituire i fotorecettori degenerati e ripristinare la visione. Infatti, è stato dimostrato di recente che tali cellule precursori fotorecettori trapiantate suscitano criteri morfologici di fotorecettori maturi di tipo selvatico, come i segmentiesterni 3adeguatamente sviluppati, terminali sinaptici in prossimità di cellule bipolari endogene e un corpo cellulare rotondo situato nello stratonucleare esterno 2-4,nonché la capacità di integrarsi funzionalmente nel circuito neurale ospite5-7. Uno dei principi principali di questa strategia è l’uso della retina dei giovani topi postnatale giorno 4 (PN 4, PN0 è definita come giorno di nascita), con conseguente miscela di diversi tipi di cellule per il trapianto. Sullo sfondo di una futura applicazione terapeutica, questa miscela deve essere purificata per le cellule precursori del fotorecettore. CD73 è stato descritto come il primo marcatore di superficie cellulare specifico per i giovani fotorecettori nella retina8-10. Qui, dimostriamo un metodo di purificazione delle cellule precursori del fotorecettore basato su questo marcatore di superficie cellulare e con l’uso della tecnica macs (magnetic-associated cell sorting). MACS potrebbe avere vantaggi rispetto alle tecniche di smistamento delle celle attivate fluorescentmente, a causa dei tempi di smistamento rapidi e della più facile regolazione delle condizioni GMP. Potremmo dimostrare un arricchimento di ~ 90% e un tasso di integrazione fino a 3 volte superiore quando trapiantiamo la popolazione arricchita nello spazio subretinale nelle retine adulte di tipo selvatico. Pertanto, l’arricchimento cellulare precursore del fotorecettore basato su MACS e il trapianto subretinale sono tecniche affidabili e promettenti per lo sviluppo di una strategia terapeutica rigenerativa per il trattamento della degenerazione retinica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il trapianto subretinale di cellule precursori del fotorecettore rappresenta uno strumento affidabile per ottenere l’integrazione di queste cellule sensibili alla luce nelle retine ospiti innumero significativo 1,2. Ciò potrebbe consentire l’istituzione di una terapia cellulare per il trattamento delle malattie degenerative retiniche in futuro6. La popolazione donatrice di cellule, attualmente isolata dalle retine PN 4, è una miscela di diversi tipi di cellule, da cui solo le cellule precursori del fotorecettore si in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ci piace ringraziare Anand Swaroop per aver fornito topi Nrl-GFP, Jochen Haas per il supporto tecnico e Sindy Böhme ed Emely Lessmann per l’allevamento.
Questo lavoro è stato supportato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 – Center of Regenerative Therapies Dresden, dal CRTD Seed Grant Program, dall’SFB 655 e dal ProRetina e.V. fondazione, il DIGS-BB Graduate Program Dresden e il Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)
Materials
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | supplied DNase I is not used in the method |
| purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stock concentration 0.5mg/ml |
| Goat Anti-Rat IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Total volume of 2ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to count the total number of cells |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | – |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Used for dissociation of the retinas |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Used to count the total number of cells |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | – | – |
| Domitor | Pfizer | 76579 | – |
| Ketamin 10% | Ratiopharm | 7538843 | – |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | – |
| Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% | University clinics Dresden pharmacy | – | – |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | – |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | – |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | – |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | – |
| fire polish glass pasteur pipette | Brand | 74777 20 | The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved. |
| MACS 15ml tube rack | Miltenyi | 130-091-052 | – |
| Cell count chamber | Carl Roth | T728.1 | – |
| Sterile 15ml tubes | Greiner Bio-one | 188271 | – |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | can be used instead of Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | can be used instead of Leica M651 MSD |
| Olympus inverted stereo microscope CKX41 | Olympus | CKX41 | – |
| Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo scientific | 51025411 | – |
| 1.5ml reaction tube | Sarstedt | 727706400 | – |
| 2ml reaction tube | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Centrifuge 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | – |
| Mouse head holder | myNeurolab | 471030 | – |
| BD Microlance 3 30G 1/2” | BD Pharmingen | 304000 | – |
| Hamilton microliter syringe 5µl, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | delivered without needles |
| Hamilton RN special needle GA34 | Hamilton | 065-207434 | Blunt, 12mm length |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – 5mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15003-08 | – |
| Dumont #7 Forceps – Titanium Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | – |
| Diamond pen | Tools-tech | – | – |
| 15x15mm Cover slips | Sparks | MIC3366 | – |
References
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