في الموقع TEM من الجمعيات البيولوجية في السائل
Summary
هنا نصف إجراء لتصوير المجمعات الفيروسية في السائل في قرار نانومتر باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال.
Abstract
يستخدم الباحثون بانتظام المجاهر الإلكترونية الإرسال (TEMs) لفحص الكيانات البيولوجية وتقييم المواد الجديدة. هنا، ونحن نصف تطبيق إضافي لهذه الصكوك- عرض التجمعات الفيروسية في بيئة سائلة. هذه الطريقة المثيرة والجديدة لتصور الهياكل البيولوجية تستخدم حامل عينة microfluidic المتقدمة مؤخرا. يوضح مقال الفيديو الخاص بنا كيفية تجميع واستخدام حامل microfluidic لتصوير العينات السائلة داخل TEM. على وجه الخصوص، نستخدم جزيئات ثنائية الطبقات من فيروس الروتا سيميان (DLPs) كنظام نموذج لدينا. كما نقوم بوصف الخطوات اللازمة لتغطية سطح الغرفة السائلة بأغشية بيولوجية تقارب تربط DLPs بنافذة المشاهدة. هذا يسمح لنا لتصوير التجميعات بطريقة مناسبة لتحديد هيكل 3D. وهكذا، نقدم لمحة أولى عن الجسيمات شبه البيئية في بيئة سائلة أصلية.
Introduction
الهدف المشترك لعلماء الأحياء والمهندسين هو فهم الأعمال الداخلية للآلات الجزيئية. المجاهر الإلكترونية انتقال (TEMs) هي أدوات مثالية لتصور هذه التفاصيل المعقدة في القرار شبه الذري1-2. من أجل الحفاظ على نظام فراغ عالية من TEM، وعادة ما تكون جزءا لا يتجزأ من العينات البيولوجية في أفلام رقيقة من الجليد الزجاجي3،والسكريات4، والأملاحالمعدنية الثقيلة5،أو مزيج من بعض من6. ونتيجة لذلك، قد تكشف صور العينات المضمنة عن لقطات محدودة فقط للعمليات الديناميكية.
قام بارسونز وزملاؤه بمحاولات مبكرة للحفاظ على العينات البيولوجية المرطبة في الغرف السائلة البيئية باستخدام مراحل ضخ تفاضلية. تم تسجيل أنماط الحيود الإلكترون من بلورات كاتالاز غير ملطخة بنجاح إلى قرار من 3 Å في حالةرطبة 7-8. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن فحص مجالات الدهون المنفصلة مرحليا في الأغشية المائية من كرات الدم الحمراء البشرية9-10. ومع ذلك ، فإن الحركة الناجمة عن نشر السائل وتدخله في شعاع الإلكترون ، أدت إلى فقدان شديد للقرار ولم تتم محاولة إجراء المزيد من التجارب باستخدام العينات البيولوجية حتى وقت قريب.
وقد تم إدخال أصحاب العينات الدقيقة الفلورية المطورة حديثا التي تستخدم رقائق أشباه الموصلات لتشكيل غرفة بيئية صغيرة الحجم. يمكن لهذه الأجهزة الحفاظ على عينات في السائل في حين يتم وضعها في عمود TEM11-12. وقد سمح هذا الاختراق التقني في التصوير TEM الباحثين لعرض، للمرة الأولى، الأحداث التقدمية على المستوى الجزيئي13. نشير إلى هذه الطريقة الجديدة باسم“في الموقع المجهر الجزيئي” كما يمكن الآن إجراء التجارب “داخل” العمود EM14-15. الهدف العام لهذه الطريقة هو تصوير التجمعات البيولوجية في السائل من أجل مراقبة سلوكياتها الديناميكية بدقة نانومتر. والأساس المنطقي وراء هذه التقنية المتقدمة هو تسجيل الملاحظات في الوقت الحقيقي ودراسة الخصائص الجديدة للآلات البيولوجية في الحل. هذه المنهجية توسع استخدام TEMs لأغراض أوسع في البيولوجيا الخلوية والجزيئية12-16.
في مقال الفيديو الحالي ، نقدم بروتوكولا شاملا لتجميع واستخدام حامل عينة microfluidic متاح تجاريا. يستخدم هؤلاء أصحاب المتخصصة رقاقات نيتريد السيليكون المنتجة مع الفواصل المتكاملة لتشكيل غرفة السائل الذي يحيط أحجام دقيقة من الحل. يتم حفر رقيقة وشفافة النوافذ في الرقائق الدقيقة لأغراض التصوير12. نحن نثبت الاستخدام السليم لحامل microfluidic لفحص جزيئات فيروس الروتا سيميان ذات الطبقات المزدوجة (DLPs) في السائل باستخدام TEM. لضمان أن التجمعات البيولوجية ، مثل DLPs ، لا تنتشر بسرعة على مسافات كبيرة أثناء التصوير ، نستخدم نهج التقاط التقارب لربطها بسطح الغرفةالدقيقة 16. هذه الخطوة التقاط الجزيئية له ميزة كبيرة على التقنيات البديلة لتصوير العينات البيولوجية في السائل لأنه يسمح للحصول على الصور التي سيتم استخدامها لروتين معالجة المصب. هذه الخطوة التقاط المستخدمة جنبا إلى جنب مع التصوير microfluidic فريدة من نوعها لإجراءاتنا17. القراء الذين يستخدمون تطبيقات البيولوجيا الهيكلية باستخدام TEM أو غرف التصوير microfluidic قد تنظر في استخدام تقنيات التقاط تقارب عندما الملاحظات الديناميكية على المستوى الجزيئي هي الهدف النهائي.
Protocol
Representative Results
Discussion
في عملنا المقدم ، استخدمنا نهج التقاط التقارب لربط DLPs فيروس الروتا إلى منصة microfluidic. وقد سمح ذلك بالتصوير الموقعي للمجمعات الجزيئية الكبيرة في بيئة دقيقة سائلة. نهج التقاط كبيرة فيما يتعلق تقنيات التصوير microfluidic أخرى لأنه ي توطين العينات البيولوجية إلى نافذة التصوير لنفي القض…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفون بالدكتور مايكل ج. فريدلاندر، مدير معهد فرجينيا للتكنولوجيا كاريليون للأبحاث لتشجيعه مساعينا البحثية. وقد تم دعم هذا المشروع من خلال صناديق التنمية لS.M.M وD.F.K. وجزئيا بمبادرة نانو بيو من معهد التكنولوجيا الحرجة والعلوم التطبيقية في جامعة فرجينيا للتكنولوجيا.
Materials
| E-chips, spacer chip | Protochips, Inc. | EPB-52TBD | 400 μm x 50 μm window |
| E-chip, top chip | Protochips, Inc. | EPT-45W | 400 μm x 50 μm window |
| Ni-NTA lipid | Avanti Polar Lipids | 790404P | Powder form |
| DLPC (12:0) lipid | Avanti Polar Lipids | 850335P | Powder form |
| Volumetric flasks | Fisher Scientific | 20-812A; 20-812C | 1 ml; 5 ml |
| Hamilton Syringes | Hamilton Co. | 80300, 80400 | 1-10 μl; 1-25 μl |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Glass Petri dishes | Corning | 70165-101 | 100 mm x 15 mm |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14673-010 | 14673-010 |
| Glass culture tubes | VWR | 47729-566 | 6 mm x 50 mm |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 L |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 L |
| Chloroform | Electron Microcopy Sciences | 12550 | 100 ml |
| His-tagged Protein A | Abcam, Inc. | ab52953 | 10 mg |
| Milli-Q water system | EMD Millipore Corp. | Z00QSV001 | Ultrapure Water |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | 500 g |
| Equipment | |||
| Poseidon In situ specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible | |
| FEI Spirit BioTwin TEM | FEI Co. | 120 kV | |
| Eagle 2k HS CCD camera | FEI Co. | 10 Å/pixel sampling at 30,000X | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Isotemp heated stir plate | Fisher Scientific | Heat to 150 ºC for 1.5 hr |
References
- Zhou, Z. H. Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).
- Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Subunit interactions in bovine papillomavirus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).
- Unwin, P. N., Henderson, R. Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens. J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. . Negative Staining and Image Classification – Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
- Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. Cryo-negative staining. Micron. 29, 145-160 (1998).
- Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186, 407-414 (1974).
- Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects. Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184, 77-78 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).
- Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
- Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
- Peckys, D. B., de Jonge, N. Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).
- Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. Transmission electron microscopy with a liquid flow cell. J. Microsc. 242, 117-123 (2011).
- Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).
- Gilmore, B. L., et al. Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere. Lab Chip. 13, 216-219 (2013).
- Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. Purification and characterization of bovine rotavirus cores. J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).
- Frank, J., et al. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).
- Zhang, X., et al. Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).
- Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).
- Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification. J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).
