सीटू में तरल में जैविक विधानसभाओं के TEM
Summary
यहां हम ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके नैनोमीटर रिज़ॉल्यूशन पर तरल में वायरल कॉम्प्लेक्स को इमेज करने की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं।
Abstract
शोधकर्ता जैविक संस्थाओं की जांच करने और नई सामग्रियों का आकलन करने के लिए नियमित रूप से ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (TEMs) का उपयोग करते हैं । यहां, हम इन उपकरणों के लिए एक अतिरिक्त आवेदन का वर्णन-एक तरल वातावरण में वायरल विधानसभाओं को देखने । जैविक संरचनाओं की कल्पना करने की यह रोमांचक और उपन्यास विधि हाल ही में विकसित माइक्रोफ्लुइडिक-आधारित नमूना धारक का उपयोग करती है। हमारा वीडियो लेख दर्शाता है कि कैसे एक TEM के भीतर तरल नमूनों की छवि के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक धारक को इकट्ठा और उपयोग करना है। विशेष रूप से, हम अपने मॉडल सिस्टम के रूप में सिमियन रोटावायरस डबल-लेयर्ड कणों (डीएलसीपी) का उपयोग करते हैं। हम एफिनिटी बायोफिल्म्स के साथ तरल कक्ष की सतह को कोट करने के चरणों का भी वर्णन करते हैं जो डीबीपीएस को देखने वाली खिड़की पर सीमित करते हैं। यह हमें इस तरीके से विधानसभाओं की छवि बनाने की अनुमति देता है जो 3डी संरचना निर्धारण के लिए उपयुक्त है। इस प्रकार, हम एक देशी तरल वातावरण में उपवायरल कणों की पहली झलक पेश करते हैं।
Introduction
जीव विज्ञानियों और इंजीनियरों का एक आम लक्ष्य आणविक मशीनों के आंतरिक कामकाज को समझना है। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (TEMs) के पास परमाणु संकल्प1-2पर इन जटिल विवरणों की कल्पना करने के लिए आदर्श उपकरण हैं । टेम की उच्च वैक्यूम प्रणाली को बनाए रखने के लिए, जैविक नमूने आमतौर पर विट्रियस आइस3,शर्करा4,भारी धातु लवण5,याउसकेकुछ संयोजन की पतली फिल्मों में एम्बेडेड होते हैं। नतीजतन, एम्बेडेड नमूनों की छवियां गतिशील प्रक्रियाओं के केवल सीमित स्नैपशॉट प्रकट कर सकती हैं।
पर्यावरणीय तरल कक्षों में हाइड्रेटेड जैविक नमूनों को बनाए रखने के प्रारंभिक प्रयास पार्संस और सहयोगियों द्वारा अंतर पंपिंग चरणों का उपयोग करके किए गए थे। अन दागदार कैटालैस क्रिस्टल के इलेक्ट्रॉन विवर्तन पैटर्न को सफलतापूर्वक हाइड्रेटेड राज्य7-8में 3 Å के संकल्प में दर्ज किया गया था। इसके अलावा, मानव एरिथ्रोसाइट्स9-10के हाइड्रेटेड झिल्ली में चरण-अलग लिपिड डोमेन की जांच की जा सकती है। हालांकि, तरल और इलेक्ट्रॉन बीम के साथ इसके हस्तक्षेप को फैलाने के कारण गति, गंभीर संकल्प हानि के परिणामस्वरूप और जैविक नमूनों का उपयोग करके आगे के प्रयोगों का हाल तक प्रयास नहीं किया गया था।
नव विकसित माइक्रोफ्लुइडिक नमूना धारकों को पेश किया गया है जो माइक्रो-स्केल पर्यावरण कक्ष बनाने के लिए सेमीकंडक्टर माइक्रोचिप्स का उपयोग करते हैं। ये उपकरण तरल में नमूनों को बनाए रख सकते हैं, जबकि वे एक TEM कॉलम11-12में तैनात हैं । TEM इमेजिंग में इस तकनीकी सफलता शोधकर्ताओं को देखने के लिए, पहली बार, आणविक स्तर13पर प्रगतिशील घटनाओं की अनुमति दी गई है । हम इस नए तौर-तरीके को‘सीटू आणविक माइक्रोस्कोपी में’ के रूप में संदर्भित करते हैं क्योंकि प्रयोग अब ईएम कॉलम14-15के “अंदर” किए जा सकते हैं। इस विधि का समग्र लक्ष्य नैनोमीटर संकल्प पर उनके गतिशील व्यवहार का निरीक्षण करने के लिए तरल में जैविक विधानसभाओं की छवि बनाना है। विकसित तकनीक के पीछे तर्क वास्तविक समय टिप्पणियों को रिकॉर्ड करना और समाधान में जैविक मशीनरी के नए गुणों की जांच करना है। यह पद्धति सेलुलर और आणविक जीव विज्ञान12-16में व्यापक उद्देश्यों के लिए TEMs के उपयोग का विस्तार करती है ।
वर्तमान वीडियो लेख में, हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोफ्लुइडिक नमूना धारक को इकट्ठा करने और उपयोग करने के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। ये विशेष धारक एकीकृत स्पेसर्स के साथ उत्पादित सिलिकॉन नाइट्राइड माइक्रोचिप्स का उपयोग एक तरल कक्ष बनाने के लिए करते हैं जो समाधान की मिनट की मात्रा को संलग्न करता है। पतली, पारदर्शी खिड़कियां इमेजिंग उद्देश्यों के लिए माइक्रोचिप्स में नक़्क़ाशीदार हैं12। हम एक TEM का उपयोग कर तरल में सिमियन रोटावायरस डबल स्तरित कणों (DLPs) की जांच करने के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक धारक के उचित उपयोग का प्रदर्शन करते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि डीएलसीपी जैसी जैविक असेंबली, इमेजिंग करते समय बड़ी दूरी पर तेजी से फैलाना नहीं है, हम उन्हें माइक्रोफ्लुइडिक चैंबर16की सतह पर सीमित करने के लिए आत्मीयता कैप्चर दृष्टिकोण को नियोजित करते हैं। इस आणविक कैप्चर चरण को तरल में जैविक नमूनों की इमेजिंग के लिए वैकल्पिक तकनीकों पर एक बड़ा लाभ है क्योंकि यह उन छवियों के अधिग्रहण के लिए अनुमति देता है जिनका उपयोग डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण दिनचर्या के लिए किया जाएगा। माइक्रोफ्लुइडिक इमेजिंग के साथ मिलकर इस्तेमाल किया जाने वाला यह कैप्चर स्टेप हमारी प्रक्रियाओं के लिए अद्वितीय है17. TEM या microfluidic इमेजिंग कक्षों का उपयोग कर संरचनात्मक जीव विज्ञान अनुप्रयोगों को रोजगार पाठकों आत्मीयता पर कब्जा तकनीकों के उपयोग पर विचार कर सकते है जब आणविक स्तर पर गतिशील टिप्पणियों अंत लक्ष्य हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमारे प्रस्तुत काम में, हमने रोटावायरस डील्प्स को माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म पर आत्मीयता कैप्चर दृष्टिकोण नियोजित किया। यह तरल माइक्रोएनवायरमेंट में मैक्रोमॉलिकुलर परिसरों की सीटू इमेजिंग म?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक हमारे शोध प्रयासों को प्रोत्साहित करने के लिए वर्जीनिया टेक कैरिलियन रिसर्च इंस्टीट्यूट के निदेशक डॉ माइकल जे फ्रीलैंडर को स्वीकार करते हैं । इस परियोजना को विकास कोष द्वारा एस.M.M और D.F.K. के लिए और भाग में क्रिटिकल टेक्नोलॉजी और एप्लाइड साइंस के लिए वर्जीनिया टेक में संस्थान के नैनो जैव पहल द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| E-chips, spacer chip | Protochips, Inc. | EPB-52TBD | 400 μm x 50 μm window |
| E-chip, top chip | Protochips, Inc. | EPT-45W | 400 μm x 50 μm window |
| Ni-NTA lipid | Avanti Polar Lipids | 790404P | Powder form |
| DLPC (12:0) lipid | Avanti Polar Lipids | 850335P | Powder form |
| Volumetric flasks | Fisher Scientific | 20-812A; 20-812C | 1 ml; 5 ml |
| Hamilton Syringes | Hamilton Co. | 80300, 80400 | 1-10 μl; 1-25 μl |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Glass Petri dishes | Corning | 70165-101 | 100 mm x 15 mm |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14673-010 | 14673-010 |
| Glass culture tubes | VWR | 47729-566 | 6 mm x 50 mm |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 L |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 L |
| Chloroform | Electron Microcopy Sciences | 12550 | 100 ml |
| His-tagged Protein A | Abcam, Inc. | ab52953 | 10 mg |
| Milli-Q water system | EMD Millipore Corp. | Z00QSV001 | Ultrapure Water |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | 500 g |
| Equipment | |||
| Poseidon In situ specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible | |
| FEI Spirit BioTwin TEM | FEI Co. | 120 kV | |
| Eagle 2k HS CCD camera | FEI Co. | 10 Å/pixel sampling at 30,000X | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Isotemp heated stir plate | Fisher Scientific | Heat to 150 ºC for 1.5 hr |
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