In situ TEM de Assembleias Biológicas em Líquido
Summary
Aqui descrevemos um procedimento para imagem de complexos virais em liquidez em resolução de nanômetros usando um microscópio eletrônico de transmissão.
Abstract
Os pesquisadores usam regularmente microscópios eletrônicos de transmissão (TEMs) para examinar entidades biológicas e avaliar novos materiais. Aqui, descrevemos uma aplicação adicional para esses instrumentos: visualização de conjuntos virais em um ambiente líquido. Este excitante e novo método de visualização de estruturas biológicas utiliza um suporte de espécimes de base microfluidic recentemente desenvolvido. Nosso artigo em vídeo demonstra como montar e usar um suporte microfluido para imagem de amostras líquidas dentro de um TEM. Em particular, usamos partículas de rotavírus de dupla camada (DLPs) como nosso sistema modelo. Também descrevemos passos para revestir a superfície da câmara líquida com biofilmes de afinidade que amarram DLPs à janela de visualização. Isso nos permite fazer assembleias de imagem de forma adequada para a determinação da estrutura 3D. Assim, apresentamos um primeiro vislumbre de partículas subvirais em um ambiente líquido nativo.
Introduction
Um objetivo comum de biólogos e engenheiros é entender o funcionamento interno das máquinas moleculares. Os microscópios eletrônicos de transmissão (TEMs) são instrumentos ideais para visualizar esses detalhes intrincados na resolução quase atômica1-2. Para sustentar o sistema de alto vácuo de um TEM, as amostras biológicas são tipicamente incorporadas em pelíneas de gelo vítreo3, açúcares4,sais de metal pesado5, ou alguma combinação de6. Como resultado, imagens de espécimes incorporados podem revelar apenas instantâneos limitados de processos dinâmicos.
As primeiras tentativas de manter espécimes biológicos hidratados em câmaras de líquidos ambientais foram realizadas por Parsons e colegas utilizando estágios diferenciais de bombeamento. Padrões de difração eletrônica de cristais catalase não manchados foram registrados com sucesso em uma resolução de 3 Å em um estado hidratado7-8. Além disso, domínios lipíduos separados em fases poderiam ser examinados em membranas hidratadas de eritrócitos humanos9-10. No entanto, o movimento causado pela difusão do líquido e sua interferência com o feixe de elétrons, resultou em perda severa de resolução e outros experimentos usando espécimes biológicos não foram tentados até recentemente.
Recém-desenvolvidos foram introduzidos portadores de amostras microfluidas que utilizam microchips semicondutores para formar uma câmara ambiental microes em escala. Estes dispositivos podem manter amostras em líquido enquanto estão posicionados em uma coluna TEM11-12. Esse avanço técnico na imagem TEM permitiu que os pesquisadores vissem, pela primeira vez, eventos progressivos no nível molecular13. Referimo-nos a esta nova modalidade como ” microscopia molecularin situ”, pois os experimentos agora podem ser realizados “dentro” da coluna EM14-15. O objetivo geral deste método é imaginar conjuntos biológicos em líquido, a fim de observar seus comportamentos dinâmicos na resolução de nanômetros. A lógica por trás da técnica desenvolvida é registrar observações em tempo real e examinar novas propriedades do maquinário biológico em solução. Essa metodologia amplia o uso de TEMs para fins mais amplos em biologia celular e molecular12-16.
No artigo de vídeo atual, apresentamos um protocolo abrangente para montar e usar um suporte de espécime microfluidic comercialmente disponível. Esses suportes especializados utilizam microchips de nitreto de silício produzidos com espaçadores integrados para formar uma câmara líquida que inclua volumes minuciosos de solução. Janelas finas e transparentes são gravadas nos microchips para fins de imagem12. Demonstramos o uso adequado de um suporte microfluido para examinar partículas de rotavírus de dupla camada (DLPs) em camadas sídicas em líquido usando um TEM. Para garantir que os conjuntos biológicos, como os DLPs, não se difundam rapidamente em grandes distâncias durante a imagem, empregamos a abordagem Affinity Capture para amarrá-los à superfície da câmara microfluidica16. Esta etapa de captura molecular tem uma grande vantagem sobre técnicas alternativas para imagens de amostras biológicas em líquido, pois permite a aquisição de imagens que serão usadas para rotinas de processamento a jusante. Esta etapa de captura usada em conjunto com a imagem microfluidica é exclusiva dos nossos procedimentos17. Os leitores que utilizam aplicações de biologia estrutural usando câmaras de imagem TEM ou microfluidic podem considerar o uso de técnicas de captura de afinidade quando observações dinâmicas no nível molecular são o objetivo final.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em nosso trabalho apresentado, utilizamos a abordagem de captura de afinidade para dLPs rotavírus de tether para uma plataforma microfluida. Isso permitiu imagens in situ de complexos macromoleculares em um microambiente líquido. A abordagem de captura é significativa em relação a outras técnicas de imagem microfluidica, pois localiza espécimes biológicos na janela de imagem para negar grandes problemas difusivos que surgem durante a gravação de imagens em líquido. No entanto, uma das …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem o Dr. Michael J. Friedlander, Diretor do Instituto de Pesquisa Virginia Tech Carilion por incentivar nossos esforços de pesquisa. Este projeto foi apoiado por fundos de desenvolvimento para S.M.M e D.F.K. e, em parte, pela iniciativa Nano-Bio do Institute for Critical Technology and Applied Science da Virginia Tech.
Materials
| E-chips, spacer chip | Protochips, Inc. | EPB-52TBD | 400 μm x 50 μm window |
| E-chip, top chip | Protochips, Inc. | EPT-45W | 400 μm x 50 μm window |
| Ni-NTA lipid | Avanti Polar Lipids | 790404P | Powder form |
| DLPC (12:0) lipid | Avanti Polar Lipids | 850335P | Powder form |
| Volumetric flasks | Fisher Scientific | 20-812A; 20-812C | 1 ml; 5 ml |
| Hamilton Syringes | Hamilton Co. | 80300, 80400 | 1-10 μl; 1-25 μl |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Glass Petri dishes | Corning | 70165-101 | 100 mm x 15 mm |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14673-010 | 14673-010 |
| Glass culture tubes | VWR | 47729-566 | 6 mm x 50 mm |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 L |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 L |
| Chloroform | Electron Microcopy Sciences | 12550 | 100 ml |
| His-tagged Protein A | Abcam, Inc. | ab52953 | 10 mg |
| Milli-Q water system | EMD Millipore Corp. | Z00QSV001 | Ultrapure Water |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | 500 g |
| Equipment | |||
| Poseidon In situ specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible | |
| FEI Spirit BioTwin TEM | FEI Co. | 120 kV | |
| Eagle 2k HS CCD camera | FEI Co. | 10 Å/pixel sampling at 30,000X | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Isotemp heated stir plate | Fisher Scientific | Heat to 150 ºC for 1.5 hr |
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