V3 workflow er en vestlig blot procedure ved hjælp af pletfri geler. Den pletfri teknologi gør det muligt for forskere at visualisere proteinseparationskvaliteten, for at verificere overførselseffektiviteten og vigtigst af alt at validere ændringen i det protein, der er af interesse, ved hjælp af total proteinkvantificering som en pålidelig belastningskontrol.
Den vestlige skamplet er en meget nyttig og bredt vedtaget lab teknik, men dens udførelse er udfordrende. Arbejdsprocessen er ofte karakteriseret som en “sort boks”, fordi en eksperimentalist ikke ved, om den er blevet udført korrekt før det sidste af flere trin. Desuden er kvaliteten af vestlige blot data undertiden udfordret på grund af mangel på effektive kvalitetskontrol værktøjer på plads i hele den vestlige blotting proces. Her beskriver vi V3 vestlige workflow, som anvender pletfri teknologi til at løse de store problemer i forbindelse med den traditionelle vestlige blot protokol. Denne arbejdsgang giver forskere: 1) at køre en gel i ca 20-30 min; 2) at visualisere prøveseparationskvaliteten inden for 5 minutter efter gelløbet 3) at overføre proteiner i 3-10 min; 4) at kontrollere overførselseffektiviteten kvantitativt og vigtigst af alt 5) for at validere ændringer i niveauet af det protein af interesse ved hjælp af total protein loading kontrol. Denne nye tilgang eliminerer behovet for stripning og reprobing af skamplet for husholdningsproteiner som β-actin, β-tubulin, GAPDH osv. V3 pletfri arbejdsgang gør den vestlige skampletproces hurtigere, gennemsigtig, mere kvantitativ og pålidelig.
Western blot er en meget nyttig teknik9, men der er to store udfordringer med vestlig blotting: lang og arbejdskrævende proces og kvalitet af data. En traditionel protokol kræver ca. 2 dage. Det involverer mange trin, herunder prøveforberedelse, gelstøbning, proteinelektroforese og overførsel, membranblokering efterfulgt af antistofinkubation, billeddannelse og ganske ofte stripning, reprobing og endelig dataanalyse. Gennem hele denne proces er der ingen pålidelige og fleksible værktøjer til processtyring. Som sådan kan fejl introduceres på hvert trin, og disse fejl har potentialet til at generere dataartefakter; Derfor er lastningskontrol afgørende for vestlig blotting for at identificere og rette fejlene. Belastningskontrollen udføres normalt ved at kontrollere proteinniveauet for et referenceprotein i hver prøve for at se, om det er ligeligt præsenteret. Folk bruger ofte husholdningsproteiner, såsom β-actin, β-tubulin, GAPDH, som lastningskontrol.
Kvaliteten af vestlige blot data afhænger af pålidelig lastning kontrol. Men der er to legitime betænkeligheder ved anvendelsen af husholdningsproteiner til lastningskontrol: 1) den antistofbaserede immunodesektion af husholdningsproteinbåndene er ofte mættet, og derfor kan man ikke skelne mellem belastningsforskellene mellem prøverne30; 2) niveauet for husholdningsproteinudtryk kan variere i prøverne under visse forsøgsbetingelser , for eksempel siRNA-behandling, celledød, celledifferentiering osv. På grund af disse bekymringer kræver videnskabelige tidsskrifter nu, at “der skal anvendes passende reagenser, kontroller og billeddannelsesmetoder med lineære signalområder” (Naturretningslinje). Tilsvarende beder redaktører fra Journal of Clinical Investigation om mere pålidelige lastekontroller24. Af disse grunde skal et husholdningsprotein valideres for at blive brugt som lastekontrol. For det første skal man sørge for, at det måles i det lineære dynamiske område af immunodetection metode14,29. For det andet skal man sørge for, at det udtrykkes konsekvent i alle prøver26,31,25,19,20.
En alternativ løsning til en pålidelig lastekontrol er at bruge total proteinmåling fra blot. Nogle forskere har plettet blots med samlede proteinpletter, såsom Coomassie, Flamingo Pink, Sypro Ruby, Amido Black, Ponceau S og pletfri teknologi til at måle det samlede proteinsignal i hver vognbane som lastningskontrol16,20,13,27,1,4,12. Den samlede proteinbelastningskontrol undgår de faldgruber, der er forbundet med husholdningsproteiner. For det første er det en sand afspejling af mængden af protein, der er indlæst for hver prøve. For det andet udviser den samlede proteinplet et fremragende lineært dynamisk område i det fælles belastningsområde for western blot-analyse (10-50 μg protein i et komplekst cellelysat) og differentierer nøjagtigt belastningsforskellen mellem prøverne12.
Pletfri teknologi er en ny total protein farvning metode, hvor en unik forbindelse blandes i acrylamid gel løsning og jævnt fordelt i støbt gel. Når elektroforese er afsluttet, udsættes gelen for UV-lys i mindst 1 minut, så pletblandingen reagerer med tryptofanresterne i proteinet. Proteinerne bliver spændende under UV-lys for at give et stærkt fluorescerende signal, der kan visualiseres og kvantificeres i en pletfri aktiveret billedsprog som ChemiDoc MP-systemet. Selve den pletfri forbindelse absorberer imidlertid ikke UV-lys, hvilket resulterer i lav baggrund af gelbilledet. Ændringen af tryptofanresterne er irreversibel, og proteiner kan visualiseres ikke kun i gelen, men også på blot når som helst efter proteinoverførsel.
Den pletfri teknologi anvendes i V3 Western Workflow (Figur 1) til at løse de store klager over den traditionelle arbejdsgang, især bekymringerne ved at bruge husholdningsproteiner som lastningskontrol. Ved hjælp af denne arbejdsgang kunne man: 1) køre en gel i ca. 20-30 minutter, 2) kontrollere prøveintegritet og proteinseparationskvalitet på 5 minutter efter gelkørsel; 3) overføre proteiner i 3-10 min; 4) kontrollere overførselseffektiviteten kvantitativt og 5) vigtigst af alt, validere ændringer i niveauet af protein af interesse ved hjælp af total protein loading kontrol.
Den V3 pletfri protokol, der er beskrevet ovenfor, er til multipleksering af fluorescerende vestlig blotting. Det kan også anvendes i vestlige blotting ved hjælp af chemiluminescent afsløring. I multiplex fluorescerende vestlige blot protokol, den pletfri blot billeder er erhvervet på to tidspunkter: 1) lige efter protein overførsel; 2) ved multiplex fluorescerende billeddannelse trin efter antistof inkubation. Det første pletfri billede bruges til at beregne overførselseffektivitet, og det andet pletfrie billede bruges som lastekontrol. Når chemiluminescent-metoden anvendes, er det ikke muligt at tage et multiplexbillede til de pletfri og målproteinsignaler, fordi chemiluminescent-signalet også vises i den pletfri kanal. I dette tilfælde anbefaler vi at bruge det pletfri billede, der er taget lige efter proteinoverførselstrinnet til lastningskontrol og normaliseringsanalyse.
V3 vestlige arbejdsgang giver følgende unikke fordele i forhold til den traditionelle vestlige blot workflow, der bruger husholdningsproteiner som lastning kontrol:
For det første giver V3-arbejdsgangen en praktisk, praktisk og mere pålidelig belastningskontrol for at validere ændringerne i niveauet af det protein, der er af interesse. V3-protokollen bruger en total proteinbelastningskontrol til at normalisere niveauet af det protein af interesse, der måles i hver prøve. Det undgår to faldgruber ved at bruge husholdningsproteinerne som lastningskontrol: mættet immunodetection og inkonsekvente husholdningsproteinudtryksniveauer blandt prøverne under visse eksperimentelle forhold. Stripning og reprobing trin med antistoffer rettet mod husholdning er ikke længere nødvendigt. Ved hjælp af pletfri teknologi er der ingen grund til at plette og plette en skamplet med pletter som Coomassie eller Sypro Ruby til total proteinmåling. Det tager kun et par sekunder at erhverve en skamplet billede og omkring 5 minutter til at gøre den samlede protein normalisering ved hjælp af Image Lab software.
For det andet giver V3-arbejdsgangen forskerne mulighed for at tage bedre kontrol over den vestlige procedure, fordi den gør proceduren mere gennemsigtig og introducerer flere checkpoints til kvalitetskontrol. Ved hjælp af pletfri teknologi kan forskere visualisere deres proteinprøver på både gelen og blot. Forskere kan vurdere proteinprøvens integritet (forringet eller ej), adskillelseskvalitet (udfældet eller ej), overførselseffektivitet og overførselskvalitet (endda overførsel eller ej). Disse checkpoints hjælper forsker opsige eksperimentet, når de ser store fejl i processen og undgå at spilde tid på dårlige prøver og pletter. Denne teknologi hjælper også forskere med at vurdere, om der er en betydelig mængde proteintab efter membranstripping, og om blot er egnet til at genprobere et andet mål 4.
Her er et par tips til at sikre god oplevelse og kvalitet data ved hjælp af V3 vestlige arbejdsgang.
Det er vigtigt at bemærke, at det pletfrie molekyle efter UV-aktivering er uigenkaldeligt bundet til tryptofanrester. Denne irreversible ændring kan potentielt påvirke antigengenkendelsen, når der bruges monoklonale antistoffer, hvis epitopen indeholder tryptofan. Polyklonale antistoffer vil sandsynligvis ikke blive påvirket, fordi de genkender flere epitoper på antigenet. Ubundne pletfri molekyler vaskes let af gelen og membranen og vil derfor ikke forstyrre antistof-antigeninteraktioner.
Afslutningsvis gør V3 vestlige arbejdsgang den vestlige skamplet proces hurtigere, mere gennemsigtig, kvantitative og mere pålidelige. Forskere kan nu nemt anvende total proteinbelastningskontrol i et vestligt blot-eksperiment for at gøre deres data mere troværdige. Den V3 pletfri arbejdsgang er blevet vedtaget af en række laboratorier, og deres publikationer har vist, at tidsskrifter accepterer pletfri data som lastning kontrol i det vestlige blot22,17,7,8,5,23,18,15.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Dr. Wolf-Dieter Stalz, Dr. Arnaud Remy, Dr. Anton Posch, Dr. Patricia Piatti, Tom Davies, Kris Simonyi og Jeff Durban for deres kritiske gennemgang og redigering af dette manuskript. Forfatterne takker også Allison Schwartz for teknisk support.
REAGENTS | |||
4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel | Bio-Rad | 567-8093 | Choose a gel size and percentage that meet the specific need in a experiment |
Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs | Bio-Rad | 170-4157 | Choose either PVDF or nitrocellulose and match the membrane size to the gel size |
Clarity Western ECL Substrate, 500 ml | Bio-Rad | 170-5061 | |
[header] | |||
EQUIPMENT | |||
Criterion Cell | Bio-Rad | 165-6100 | |
Trans-Blot Turbo Transfer Starter System | Bio-Rad | 170-4155 | |
ChemiDoc MP System | Bio-Rad | 170-8280 |