Isolering af myeloide dendritiske celler og epitelceller fra human Thymus
Summary
Denne protokol beskriver en metode til isolering af antigen-præsenterende celler fra human thymus via forskellige trin af enzymatisk spaltning af vævet efterfulgt af densitetscentrifugering af enkelt cellesuspension og endelig magnetiske og / eller FACS-sortering af cellepopulationer af interesse.
Abstract
I denne protokol giver vi en metode til at isolere dendritiske celler (DC) og epitelceller (TEC) fra det menneskelige thymus. DC og TEC er den største antigenpræsenterende celle (APC) typer findes i en normal thymus, og det er velkendt, at de spiller forskellige roller i løbet af thymisk valg. Disse celler er lokaliseret i forskellige mikromiljøer i thymus, og hver APC typen udgør kun en mindre population af celler. For yderligere at forstå biologi disse celletyper, karakteriseringen af disse cellepopulationer er meget ønskeligt, men på grund af deres lave frekvens, isolering af nogen af disse celletyper kræver en effektiv og reproducerbar fremgangsmåde. Denne protokol beskriver en metode til at opnå celler er egnede til karakterisering af forskellige cellulære egenskaber. Thymisk væv mekanisk forstyrret og efter forskellige trin i enzymatisk fordøjelse, er den resulterende cellesuspension beriget ved hjælp af en Percoll densitet centrifugering. Til isolering af myeloid DC (CD11 <sup> +) celler fra fraktionen med lav massefylde (LDF) er immunoselected ved magnetisk cellesortering. Berigelse af TEC populationer (MTEC, CTec) opnås ved udtømning af hæmatopoietiske (CD45 hi) celler fra low-density Percoll celle fraktion lade deres efterfølgende isolation via fluorescens aktiveret celle sortering (FACS) ved hjælp af specifikke cellemarkører den. De isolerede celler kan anvendes til forskellige efterfølgende anvendelser.
Introduction
Thymus er det organ, hvor T-celle-udvikling forekommer. Dets relative og absolutte størrelse falder med alderen, når det bliver successivt erstattet af fedt, selvom thymisk aktivitet stadig kan påvises i alderdommen. Dens betydning for immunresponset blev påvist i begyndelsen af 1960'erne 1..
T-celle-repertoire er formet gennem interaktion af T-celle-receptorer med peptid-MHC-komplekser på forskellige typer af thymus APC, som giver overlevelse eller død signaler på at udvikle T-celler, hvilket resulterer i en funktionel og i vid udstrækning selv-tolerant T-celle-repertoire 2.
Ca. 98% af cellerne i den menneskelige thymus udvikler T-celler omtalt som celler thymocytter. De resterende 2% består af en række forskellige celletyper, herunder en række af TEC (kortikal, medullær, subkapsulær), myeloide og plasmacytoid DC (MDC PDC), makrofager, B-celler, modne re-cirkulerende T-celler, granulocytter, fibroblasts, endotelceller og meget sjældne epitelceller med et udtryk fænotype, der ligner celler fra andre væv, såsom muskel, neuroner og respiratorisk epitel (fig. 1). Af disse TEC og DC er de store APC typer findes i en normal thymus. I de senere år har rensning af disse APC typer for kultur og molekylær profilering fået mere og mere interesse. På grund af deres lave frekvens, isolering af nogen af disse celletyper detaljerede analyser kræver en effektiv, reproducerbar og omkostningseffektiv procedure. Metoden præsenteres her er en modifikation fra tidligere offentliggjorte studier 3,4.
Som med enhver anden væv kan celleekstraktion thymus opnås ved enzymatisk disaggregering celle-celle og celle-matrix-interaktion netværk, for at opnå en suspension af enkeltceller. Der er visse parametre som god dissociation effektivitet, celleudbytte, levedygtighed og fastholdelse af celle s celleoverfladetransport markører, der er afgørende og skal optimeres for en vellykket isolering af disse sjældne cellepopulationer.
I denne protokol, er isolering af DC og TEC delmængder udføres ved at lave en enkelt celle suspension af væv ved mekanisk sprængning og enzymatisk nedbrydning. Vi bruger Collagenase A fra Clostridium histolyticum, der har et afbalanceret forhold mellem forskellige enzymaktiviteter, at nedbryde native collagen, der holder vævet sammen. DNase I indgår i enzymet løsning til at reducere celleaggregering grund fri DNA fra døde celler (thymocytter er meget følsomme). Vi tilbyder også en alternativ tilgang til den typiske enzymatiske vævsfordøjelse involverer mekanisk og enzymatisk væv behandling bistået af et væv dissociator. Enkelt celle suspension underkastes derefter en enkelt Percoll-densitetscentrifugering til berigelse af lav densitet fraktion (LDF) af celler. Fra denne fraktion af celler kan DC isoleres ved farvning feller DC-overflade markører (dvs. CD11c +) og ved hjælp af magnetisk separation eller fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS). I modsætning til de lymfoide celler, der omfatter størstedelen af celler i thymus, behøver TEC ikke udtrykke CD45 ved høje niveauer, men er positive for epitelcelleadhæsionsmolekyle EpCAM. CTec kan skelnes fra medullær TEC ved ekspression af en endnu udefineret antigen genkendes af CDR-2 (kortikal dendritiske retikulocyt-2)-antistof 4,5 og noget lavere EpCAM udtryk. Den differentielle co-ekspression af EpCAM og CDR2 muliggør effektiv isolering af disse TEC undergrupper via high-speed cellesortering 6.
Protokollen præsenteres her er optimeret til human thymus væv. Varigheden af fremgangsmåden afhænger af mængden af væv og evne til forsøgslederen samt hastigheden af cellesorteringsapparatet, hvis der anvendes FACS-sortering. Normalt kan protokollen til isolering af DC være afsluttet inden for 5-6 Time og til isolering af TEC i 8-10 timer. Isolering af DC og TEC delmængder fra thymus væv er tid følsomme. Jo hurtigere isolation procedure, jo bedre tilstand af cellerne. Endelig kan de isolerede celler anvendes til yderligere undersøgelser som sammenlignende undersøgelser af mRNA og proteinekspression PCR-forsøg, proteinisolering, molekylær profilering (dvs. transcriptomics, mikro RNA-analyse) samt cellekultur 6.
Etiske retningslinjer
For at kunne arbejde med humant thymus væv forskeren har brug for at indhente godkendelse fra lokale etiske udvalg eller de ansvarlige myndigheder samt en informeret skriftligt samtykke fra donor (eller normalt sine forældre, da væv sædvanligvis er fremstillet af mindreårige børn). Desuden bør alle humane væv skal håndteres som potentielt smittefarlige og passende foranstaltninger der skal træffes, såsom at arbejde med handsker osv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet her er en ændring af den protokol, publiceret af Gotter et al 4. Kritiske trin i protokollen er den tilstand og indledende behandling af væv samt Percoll tæthed separation. Vi anbefaler stærkt at behandle vævet så hurtigt som muligt efter samling. Det er vigtigt at arbejde hurtigt, men grundigt, når rensning og skæring af vævet. Under thymocyt vask beskrevet i trin 2.3, er det afgørende at finde den rette balance, når de anvender tryk med bagsiden af sprøjteste…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for kirurgerne på Institut for thorax og kardiovaskulær kirurgi, Universitetsklinikken Tübingen for at give os de thymus prøver og Bruno Kyewski (DKFZ, Heidelberg, Tyskland) varetagelse af CDR2 antistof. Vi vil også gerne takke Hans-Jörg Bühring og Sabrina Grimm fra sorteringsanlægget (University of Tübingen). Dette arbejde blev støttet af SFB 685 og Hertie Foundation.
Materials
| Reagents and Materials | |||
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| Dulbecco's PBS | PAA | H15-002 | |
| Fetal Bovine Serum-Gold | PAA | A15-151 | |
| Bovine Serum Albumin | PAA | K41-001 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | |
| DNase I, grade II bovine pancreatic | Roche | 10 104 159 001 | |
| Trypsin-EDTA 10x in PBS | PAA | L11-001 | stock conc. 20 mg/ml |
| Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit | Molecular Probes | A-10235 | |
| anti-human CDR2 (purified) | Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany | labeled with Alexa Fluor 488 | |
| anti-human CD45 (Pacific Blue) | Biolegend | 304022 | |
| anti-human EpCAM (APC) | Miltenyi Biotec | 130-091-254 | |
| anti-human CD11c (PE) | Miltenyi Biotec | 130-092-411 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| anti-CD45 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for tissue dissociator |
| Percoll (density 1.130 g/ml) | GE Healthcare, Life Sciences | 17-0891-01 | |
| Sterile distilled Water (DNAse/ RNAse free) | GIBCO | 10977-035 | |
| Gamunex 10% | Tajecris-Biotherapeutics | G120052 | 1:10 pre-dilution, use 20 μl/1 x 106cells |
| 0.22 μm filter | Millex GS | SLGS033SS | Syringe driven |
| Stericup filter unit | Millipore | SCGPU05RE | Pump driven |
| 50 ml PC oak ridge centrifuge tubes | Nalgene | 3118-0050 | 50 ml |
| 50 ml PP conical tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| 12 mm x 75 mm 5 ml test tubes | Becton Dickinson | 352058 | FACS stainings |
| Cell strainer 70 μm | Becton Dickinson | 352350 | |
| INSTRUMENTS | |||
| Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu) | Becton Dickinson | ||
| Sorvall Evolution R6 (rotor) | Kendro | ||
| Rotator REAX 2 | Heidolph | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093 235 | tissue dissociator |
References
- Miller, J. F. A. P. The discovery of thymus function and of thymus-derived lymphocytes. Immunological Reviews. 185, 7-14 (2002).
- Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat Rev Immunol. 9, 833-844 (2009).
- Vandenabeele, S., Hochrein, H., Mavaddat, N., Winkel, K., Shortman, K. Human thymus contains 2 distinct dendritic cell populations. Blood. 97, 1733-1741 (2001).
- Gotter, J., Brors, B., Hergenhahn, M., Kyewski, B. Medullary Epithelial Cells of the Human Thymus Express a Highly Diverse Selection of Tissue-specific Genes Colocalized in Chromosomal Clusters. The Journal of Experimental Medicine. 199, 155-166 (2004).
- Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 36, 1511-1517 (1988).
- Stoeckle, C., et al. Cathepsin S dominates autoantigen processing in human thymic dendritic cells. Journal of Autoimmunity. 38, 332-343 (2012).
- Woods Ignatoski, K. M., Bingham, E. L., Frome, L. K., Doherty, G. M. Directed trans-differentiation of thymus cells into parathyroid-like cells without genetic manipulation. Tissue Eng Part C Methods. 17, 1051-1059 (2011).
- Williams, K. M., et al. Single Cell Analysis of Complex Thymus Stromal Cell Populations: Rapid Thymic Epithelia Preparation Characterizes Radiation Injury. Clinical and Translational Science. 2, 279-285 (2009).
- Bendriss-Vermare, N., et al. Human thymus contains IFN-α-producing CD11c-, myeloid CD11c+, and mature interdigitating dendritic cells. The Journal of Clinical Investigation. 107, 835-844 (2001).
- Schmitt, N., et al. Ex vivo characterization of human thymic dendritic cell subsets. Immunobiology. 212, 167-177 (2007).
- Dzionek, A., et al. BDCA-4: Three Markers for Distinct Subsets of Dendritic Cells in Human Peripheral Blood. The Journal of Immunology. 165, 6037-6046 (2000).
- Wu, L., Shortman, K. Heterogeneity of thymic dendritic cells. Seminars in Immunology. 17, 304-312 (2005).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of Immunological Methods. 385, 23-34 (2012).
- Adamopoulou, E., Tenzer, S., Hillen, N., Klug, P., Rota, I. A., Tietz, S., Gebhardt, M., Stevanovic, S., Schild, H., et al. Exploring the MHC-peptide matrix of central tolerance in the human thymus. Nature Communications. , (2013).
