Isolement des cellules dendritiques myéloïdes et les cellules épithéliales du thymus humain
Summary
Ce protocole décrit en détail une méthode pour isoler des cellules présentant l'antigène à partir de thymus humain par l'intermédiaire de différentes étapes de digestion enzymatique du tissu suivie d'une centrifugation de densité de la suspension de cellules individuelles et enfin le tri magnétique et / ou FACS des populations de cellules d'intérêt.
Abstract
Dans ce protocole, nous fournissons un procédé pour isoler des cellules dendritiques (DC) et les cellules épithéliales (TEC) à partir du thymus humain. DC et TEC sont la principale cellule présentatrice d'antigène (APC) de types trouvés dans un thymus normal et il est bien établi que ils jouent des rôles distincts lors de la sélection thymique. Ces cellules sont localisées dans des micro-environnements distincts dans le thymus et chaque type APC ne constitue qu'une petite population de cellules. Pour mieux comprendre la biologie de ces types de cellules, la caractérisation de ces populations de cellules est très souhaitable, mais en raison de leur basse fréquence, l'isolement de l'un de ces types de cellules nécessite une procédure efficace et reproductible. Ce protocole détaille une méthode pour obtenir des cellules appropriées pour la caractérisation des propriétés cellulaires divers. Tissu thymique est mécaniquement perturbé et après différentes étapes de digestion enzymatique, la suspension de cellules résultante est enrichi à l'aide d'une étape de centrifugation par densité de Percoll. Pour l'isolement des myéloïde DC (CD11c <sup> +), des cellules provenant de la fraction de faible densité (LDF) sont immunosélectionné par tri cellulaire magnétique. Enrichissement des populations de TEC (mTEC, la technologie cTEC) est réalisé par déplétion des hématopoïétiques (CD45 hi) des cellules de la fraction cellulaire de faible densité Percoll permettant leur isolement subséquent par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) en utilisant des marqueurs cellulaires spécifiques. Les cellules isolées peuvent être utilisées pour différentes applications en aval.
Introduction
Le thymus est l'organe dans lequel le développement des cellules T se produit. Sa taille relative et absolue diminue avec l'âge quand il est remplacé successivement par de la graisse bien que l'activité du thymus peut encore être détecté dans la vieillesse. Son importance pour la réponse immunitaire a été démontrée dans le début des années 1960 1.
Le répertoire des cellules T est façonnée par l'interaction des récepteurs des cellules T avec des complexes peptide-MHC sur les différents types de thymus APC, qui assurent la survie ou la mort des indices de développement de cellules T, ce qui entraîne un répertoire fonctionnel et largement auto-tolérance des lymphocytes T 2.
Environ 98% des cellules dans le thymus humain développent des lymphocytes T appelés thymocytes. Les 2% restants se composent d'un certain nombre de différents types de cellules, y compris une variété de TEC (corticale, médullaire, sous-capsulaire), myéloïde et CD plasmacytoïdes (MDC, PDC), les macrophages, les lymphocytes B, les cellules matures re-circulation T, les granulocytes, faibroblasts, les cellules endothéliales et les cellules épithéliales de très rares avec un phénotype d'expression qui ressemble à celle des cellules provenant d'autres tissus tels que les muscles, les neurones et de l'épithélium des voies respiratoires (Figure 1). Parmi ceux-ci, TEC et DC sont les principaux types d'APC présents dans un thymus normal. Au cours des dernières années, la purification de ces types d'APC pour la culture et le profilage moléculaire a gagné de plus en plus d'intérêt. En raison de leur basse fréquence, l'isolement de l'un de ces types de cellules pour une analyse détaillée nécessite une procédure efficace, reproductible et économique. La méthode présentée ici est une modification d'études publiées antérieurement 3,4.
Comme avec n'importe quel autre tissu, l'extraction des cellules du thymus peut être obtenue en décomposant par voie enzymatique de la cellule-cellule et les réseaux d'interactions cellule-matrice, pour obtenir une suspension de cellules uniques. Il existe certains paramètres comme la bonne efficacité de dissociation, le rendement cellulaire, la viabilité des cellules et le maintien des cellules smarqueurs de urface qui sont cruciales et doivent être optimisées pour l'isolement réussi de ces populations de cellules rares.
Dans ce protocole, l'isolement des sous-ensembles de DC et TEC est réalisée par formation d'une suspension à cellule unique du tissu par rupture mécanique et la digestion enzymatique. Nous utilisons la collagénase A de Clostridium histolyticum, qui a un rapport équilibré des différentes activités enzymatiques, à briser le collagène natif qui détient le tissu ensemble. DNase I est inclus dans la solution enzymatique pour réduire l'agrégation cellulaire en raison de l'ADN libre à partir de cellules mortes (thymocytes sont très sensibles). Nous fournissons également une approche alternative à la digestion du tissu enzymatique typique impliquant un traitement de tissu mécanique et enzymatique assistée par un dissociateur de tissu. La suspension cellulaire unique est ensuite soumis à une centrifugation unique de densité Percoll pour l'enrichissement de la fraction de faible densité (LDF) de cellules. A partir de cette fraction de cellules, DC peut être isolé par coloration fou marqueurs DC-surface (c.-à-CD11c +) et en utilisant une séparation magnétique ou une cellule activé par fluorescence (FACS). A la différence des cellules lymphoïdes comprenant la grande majorité des cellules dans le thymus, les TEC n'expriment pas CD45 à des niveaux élevés, mais sont positifs pour le adhésion cellulaire épithéliale molécule EpCAM. Ctec peut être distingué du TEC médullaire par l'expression d'un antigène reconnu non encore défini par le CDR-2 (cortical dendritique réticulocytes-2) un anticorps de 4,5 et l'expression d'EpCAM un peu plus faible. L'écart-co-expression de EpCAM et CDR2 permet l'isolement efficace de ces sous-ensembles de TEC par l'intermédiaire de la cellule à grande vitesse de tri 6.
Le protocole présenté ici est optimisée pour les tissus du thymus humain. La durée de la procédure dépend de la quantité de tissu et de la capacité de l'expérimentateur, ainsi que la vitesse du trieur de cellules, si tri FACS est utilisé. Normalement, le protocole pour l'isolement de CC peut être achevée dans un délai de 5-6 H et à l'isolement des TEC en 8-10 heures. L'isolement des DC et des sous-ensembles de TEC de tissu thymique est sensible au temps. Plus la procédure d'isolement, meilleure est l'état des cellules. Enfin, les cellules isolées peuvent être utilisées pour d'autres investigations, comme des études comparatives de l'ARNm et l'expression des protéines, des expériences de PCR, l'isolement de la protéine, le profilage moléculaire (à savoir les transcriptomique, micro-analyse de l'ARN), ainsi que la culture de la cellule 6.
Déclaration d'éthique
Afin d'être en mesure de travailler avec le tissu de thymus humain, le chercheur doit obtenir l'approbation du comité d'éthique local ou les autorités responsables ainsi que d'un consentement écrit du donneur (ou habituellement ses parents, puisque le tissu est généralement obtenu à partir de mineurs les enfants). En outre, tous les tissus humains doivent être traités comme étant potentiellement infectieux et des mesures appropriées doivent être prises, telles que le travail avec des gants, etc.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici est une modification du protocole publié par Gotter et al 4. Les étapes critiques dans le protocole sont la condition et la préparation initiale du tissu ainsi que la séparation de densité Percoll. Nous vous recommandons fortement de traiter le tissu le plus tôt possible après la collecte. Il est important de travailler vite mais bien lors du nettoyage et couper le tissu. Lors du lavage des thymocytes décrit à l'étape 2.3, il est essentiel de trouver le juste é…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants envers les chirurgiens du département de chirurgie thoracique et cardiovasculaire, Clinique universitaire de Tübingen pour nous fournir les échantillons de thymus et Bruno Kyewski (DKFZ, Heidelberg, Allemagne) pour fournir l'anticorps CDR2. Nous tenons également à remercier Hans-Jörg Bühring et Sabrina Grimm du centre de tri (Université de Tübingen). Ce travail a été soutenu par le SFB 685 et la Fondation Hertie.
Materials
| Reagents and Materials | |||
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| Dulbecco's PBS | PAA | H15-002 | |
| Fetal Bovine Serum-Gold | PAA | A15-151 | |
| Bovine Serum Albumin | PAA | K41-001 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | |
| DNase I, grade II bovine pancreatic | Roche | 10 104 159 001 | |
| Trypsin-EDTA 10x in PBS | PAA | L11-001 | stock conc. 20 mg/ml |
| Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit | Molecular Probes | A-10235 | |
| anti-human CDR2 (purified) | Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany | labeled with Alexa Fluor 488 | |
| anti-human CD45 (Pacific Blue) | Biolegend | 304022 | |
| anti-human EpCAM (APC) | Miltenyi Biotec | 130-091-254 | |
| anti-human CD11c (PE) | Miltenyi Biotec | 130-092-411 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| anti-CD45 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for tissue dissociator |
| Percoll (density 1.130 g/ml) | GE Healthcare, Life Sciences | 17-0891-01 | |
| Sterile distilled Water (DNAse/ RNAse free) | GIBCO | 10977-035 | |
| Gamunex 10% | Tajecris-Biotherapeutics | G120052 | 1:10 pre-dilution, use 20 μl/1 x 106cells |
| 0.22 μm filter | Millex GS | SLGS033SS | Syringe driven |
| Stericup filter unit | Millipore | SCGPU05RE | Pump driven |
| 50 ml PC oak ridge centrifuge tubes | Nalgene | 3118-0050 | 50 ml |
| 50 ml PP conical tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| 12 mm x 75 mm 5 ml test tubes | Becton Dickinson | 352058 | FACS stainings |
| Cell strainer 70 μm | Becton Dickinson | 352350 | |
| INSTRUMENTS | |||
| Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu) | Becton Dickinson | ||
| Sorvall Evolution R6 (rotor) | Kendro | ||
| Rotator REAX 2 | Heidolph | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093 235 | tissue dissociator |
References
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