בידוד של תאי מיאלואידית דנדריטים ותאי האפיתל מקורנית האדם
Summary
פרוטוקול זה מפרט שיטה לבודד תאי המציגים אנטיגנים מבלוטת התימוס אנושית דרך שלבים שונים של עיכול אנזימטי של הרקמה ואחריו צנטריפוגה צפיפות של ההשעיה התא בודדת ומיון לבסוף מגנטי ו / או FACS של אוכלוסיות התאים של עניין.
Abstract
בפרוטוקול זה אנו מספקים שיטה לבודד תאים דנדריטים (DC) ותאי אפיתל (TEC) מבלוטת התימוס האנושית. DC וTEC הם תא אנטיגן הצגה הגדול סוגים (APC) נמצאו בבלוטת התימוס נורמלית והיא מבוססת היטב כי הם ממלאים תפקידים שונים במהלך בחירה הרתי. תאים אלה הם נקודתיים במייקר ברור בבלוטת התימוס וכל סוג APC מפצה אוכלוסייה קלה בלבד של תאים. כדי להבין את הביולוגיה של סוגים אלה של תאים נוספים, אפיון של אוכלוסיות תאים אלה רצוי מאוד אך בשל התדירות הנמוכה שלהם, בידוד של כל אחד מסוגי התאים דורש הליך יעיל ושחזור. פרוטוקול זה מפרט שיטה להשיג תאים מתאימים לאפיון של תכונות סלולריות מגוונות. רקמה הרתי מופרת באופן מכאני ולאחר שלבים שונים של עיכול אנזימטי, ההשעיה תא וכתוצאה מכך הוא מועשר באמצעות צעד צנטריפוגה צפיפות Percoll. לבידודה של מיאלואידית DC (CD11c <sup> +), תאים מהשבר בצפיפות נמוכה (LDF) הם immunoselected ידי מיון תא מגנטי. העשרה של אוכלוסיות TEC (mTEC, cTEC) מושגת על ידי דלדול של תאי hematopoietic (היי CD45) מחלק תא Percoll בצפיפות נמוכה המאפשר הבידוד הבא שלהם באמצעות תא קרינה המופעל מיון (FACS) באמצעות סמני תא ספציפיים. התאים מבודדים יכולים לשמש ליישומים במורד הזרם שונים.
Introduction
התימוס הוא האיבר שבו התפתחות תא T מתרחש. גודלו היחסי והמוחלט שלה יורד עם גיל, כאשר הוא הופך להיות מוחלף ברציפות על ידי שומן למרות פעילות הרתי עדיין יכולה להתגלות בגיל המבוגר. חשיבותו לתגובה החיסונית הודגמה בתחילת 1960s 1.
רפרטואר תא T מעוצב באמצעות האינטראקציה של קולטני תא T עם מתחמי פפטיד-MHC על סוגים שונים של APC הרתי, המספקים רמזי הישרדות או מוות לפיתוח תאי T, וכתוצאה מרפרטואר תא T פונקציונלי ובעיקר עצמי סובלני 2.
כ 98% מהתאים בבלוטת התימוס האנושי מתפתחים תאי T המכונים thymocytes. 2% הנותרים מורכבים מכמה סוגי תאים שונים, כוללים מגוון רחב של TEC (קליפת המוח, מדולרית, subcapsular), מיאלואידית וDC plasmacytoid (MDC, PDC), מקרופאגים, תאי B, תאי T מחדש במחזור בוגר, גרנולוציטים של, וibroblasts, תאי אנדותל ותאי אפיתל נדירים מאוד עם פנוטיפ ביטוי דומה לזה של תאים מרקמות אחרות כגון שרירים, תאי עצב והאפיתל בדרכי הנשימה (איור 1). מתוכם, TEC ו DC הם סוגי APC העיקריים שנמצאו בבלוטת התימוס נורמלית. בשנים האחרונות, טיהור של סוגי APC הללו לתרבות ולאפיון מולקולרי צברה יותר ויותר עניין. בשל התדירות הנמוכה שלהם, בידוד של כל אחד מסוגי התאים אלה לניתוח מפורט דורש הליך יעיל, לשחזור וחסכוני. השיטה המוצגת כאן היא שינוי ממחקרים שפורסמו בעבר 3,4.
כמו בכל רקמה אחרת, מיצוי תאים מבלוטת התימוס יכול להיות מושגת על ידי אנזימי disaggregating תאי תאים ורשתות אינטראקציה תאי מטריקס, על מנת לקבל השעיה של תאים בודדים. ישנם פרמטרים מסוימים כמו יעילות דיסוציאציה טובה, תשואת תא, כדאיות תא ושמירה של תא יםסמני urface כי הם קריטיים וצריכים להיות מותאמים לבידוד המוצלח של אוכלוסיות תאים נדירות אלה.
בפרוטוקול זה, בידוד של DC ותת TEC מבוצע על ידי ביצוע השעיה תא בודד של הרקמה על ידי הפרעה מכאנית ועיכול אנזימטי. אנו משתמשים Collagenase מClostridium histolyticum, שבו יש יחס מאוזן של פעילות אנזים שונה, כדי לשבור את קולגן המקומי שמחזיק את הרקמה יחד. אני DNase כלול בפתרון האנזים כדי להפחית צבירת תא בשל DNA החופשי מהתאים מתים (thymocytes רגיש מאוד). כמו כן אנו מספקים גישה חלופית לעיכול הרקמה האנזימטית הטיפוסי מעורב טיפול רקמות מכאני והאנזימטית בסיוע Dissociator רקמות. ההשעיה התא בודדת נתונה אז צנטריפוגה צפיפות Percoll יחידה להעשרת חלק בצפיפות הנמוכה (LDF) של תאים. מחלק זה של תאים, יכול להיות מבודד DC על ידי צביעה ואו סמני DC-פני השטח (כלומר + CD11c) ושימוש בהפרדה מגנטית או תא הקרינה המופעל מיון (FACS). בניגוד לתאי הלימפה המהווים את הרוב המכריע של תאים בבלוטת התימוס, TEC אינו מבטא CD45 ברמות גבוהות, אבל הם חיוביים לEpCAM מולקולת הידבקות תא אפיתל. ניתן להבחין cTEC מTEC מהדולרי על ידי הביטוי של אנטיגן עדיין לא מוגדר שהוכר על ידי CDR-2 נוגדנים (קליפת המוח הדנדריטים reticulocyte-2) 4,5 וביטוי EpCAM נמוך במקצת. ההפרש שיתוף הביטוי של EpCAM וCDR2 מאפשר הבידוד יעיל של תת TEC אלה באמצעות סלולריים במהירות גבוהה מיון 6.
הפרוטוקול המובא כאן הוא מותאם לרקמה הרתי אנושית. משך ההליך תלוי בכמות הרקמה וביכולת של הנסיין, כמו גם את המהירות של סדרן התא, אם נעשה שימוש FACS מיון. בדרך כלל, הפרוטוקול לבידוד של DC יכול להסתיים בתוך 5שעה -6 ועבור הבידוד של TEC ב8-10 שעה. הבידוד של DC ותת TEC מרקמות הרתי הוא זמן רגיש. מהר הליך הבידוד, טוב יותר את מצבו של התאים. לבסוף, התאים מבודדים יכולים לשמש לחקירות נוספות כמו מחקרים השוואתיים של mRNA וביטוי חלבונים, ניסויי PCR, בידוד חלבון, פרופיל מולקולרי (כלומר transcriptomics, ניתוח RNA מיקרו), כמו גם תא תרבות 6.
הצהרת אתיקה
על מנת להיות מסוגל לעבוד עם רקמת התימוס אנושית החוקר צריך לקבל אישור מוועדת האתיקה המקומית או הרשויות אחראים, כמו גם הסכמה מדעת בכתב של התורם (או בדרך כלל הורים שלו או שלה, שכן רקמה בדרך כלל מתקבלת מקטינים ילדים). יתר על כן, יש לטפל בכל הרקמות האנושיות כאמצעי שעלול להיות מדבק ומתאים יש לנקוט, כגון עבודה עם כפפות, וכו '.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן הוא שינוי של הפרוטוקול שפורסם על ידי Gotter et al 4. שלבים קריטיים בפרוטוקול הם המצב והכנה ראשונית של הרקמה, כמו גם את הפרדת צפיפות Percoll. אנו ממליצים בחום לעבד את הרקמה בהקדם האפשרי לאחר איסוף. חשוב לעבוד מהר אך ביסודיות בעת ניקוי וחיתוך הרקמו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה למנתחים מהמחלקה לכירורגיית בית החזה ולב וכלי דם, אוניברסיטת מרפאת טובינגן שספק לנו דוגמאות התימוס וברונו Kyewski (DKFZ, היידלברג, גרמניה) על מתן נוגדני CDR2. כמו כן, אנו רוצים להודות לאנס יורג Bühring וסברינה גרים ממתקן המיון (אוניברסיטת טובינגן). עבודה זו נתמכה על ידי SFB 685 וקרן Hertie.
Materials
| Reagents and Materials | |||
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| Dulbecco's PBS | PAA | H15-002 | |
| Fetal Bovine Serum-Gold | PAA | A15-151 | |
| Bovine Serum Albumin | PAA | K41-001 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | |
| DNase I, grade II bovine pancreatic | Roche | 10 104 159 001 | |
| Trypsin-EDTA 10x in PBS | PAA | L11-001 | stock conc. 20 mg/ml |
| Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit | Molecular Probes | A-10235 | |
| anti-human CDR2 (purified) | Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany | labeled with Alexa Fluor 488 | |
| anti-human CD45 (Pacific Blue) | Biolegend | 304022 | |
| anti-human EpCAM (APC) | Miltenyi Biotec | 130-091-254 | |
| anti-human CD11c (PE) | Miltenyi Biotec | 130-092-411 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| anti-CD45 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for tissue dissociator |
| Percoll (density 1.130 g/ml) | GE Healthcare, Life Sciences | 17-0891-01 | |
| Sterile distilled Water (DNAse/ RNAse free) | GIBCO | 10977-035 | |
| Gamunex 10% | Tajecris-Biotherapeutics | G120052 | 1:10 pre-dilution, use 20 μl/1 x 106cells |
| 0.22 μm filter | Millex GS | SLGS033SS | Syringe driven |
| Stericup filter unit | Millipore | SCGPU05RE | Pump driven |
| 50 ml PC oak ridge centrifuge tubes | Nalgene | 3118-0050 | 50 ml |
| 50 ml PP conical tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| 12 mm x 75 mm 5 ml test tubes | Becton Dickinson | 352058 | FACS stainings |
| Cell strainer 70 μm | Becton Dickinson | 352350 | |
| INSTRUMENTS | |||
| Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu) | Becton Dickinson | ||
| Sorvall Evolution R6 (rotor) | Kendro | ||
| Rotator REAX 2 | Heidolph | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093 235 | tissue dissociator |
References
- Miller, J. F. A. P. The discovery of thymus function and of thymus-derived lymphocytes. Immunological Reviews. 185, 7-14 (2002).
- Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat Rev Immunol. 9, 833-844 (2009).
- Vandenabeele, S., Hochrein, H., Mavaddat, N., Winkel, K., Shortman, K. Human thymus contains 2 distinct dendritic cell populations. Blood. 97, 1733-1741 (2001).
- Gotter, J., Brors, B., Hergenhahn, M., Kyewski, B. Medullary Epithelial Cells of the Human Thymus Express a Highly Diverse Selection of Tissue-specific Genes Colocalized in Chromosomal Clusters. The Journal of Experimental Medicine. 199, 155-166 (2004).
- Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 36, 1511-1517 (1988).
- Stoeckle, C., et al. Cathepsin S dominates autoantigen processing in human thymic dendritic cells. Journal of Autoimmunity. 38, 332-343 (2012).
- Woods Ignatoski, K. M., Bingham, E. L., Frome, L. K., Doherty, G. M. Directed trans-differentiation of thymus cells into parathyroid-like cells without genetic manipulation. Tissue Eng Part C Methods. 17, 1051-1059 (2011).
- Williams, K. M., et al. Single Cell Analysis of Complex Thymus Stromal Cell Populations: Rapid Thymic Epithelia Preparation Characterizes Radiation Injury. Clinical and Translational Science. 2, 279-285 (2009).
- Bendriss-Vermare, N., et al. Human thymus contains IFN-α-producing CD11c-, myeloid CD11c+, and mature interdigitating dendritic cells. The Journal of Clinical Investigation. 107, 835-844 (2001).
- Schmitt, N., et al. Ex vivo characterization of human thymic dendritic cell subsets. Immunobiology. 212, 167-177 (2007).
- Dzionek, A., et al. BDCA-4: Three Markers for Distinct Subsets of Dendritic Cells in Human Peripheral Blood. The Journal of Immunology. 165, 6037-6046 (2000).
- Wu, L., Shortman, K. Heterogeneity of thymic dendritic cells. Seminars in Immunology. 17, 304-312 (2005).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of Immunological Methods. 385, 23-34 (2012).
- Adamopoulou, E., Tenzer, S., Hillen, N., Klug, P., Rota, I. A., Tietz, S., Gebhardt, M., Stevanovic, S., Schild, H., et al. Exploring the MHC-peptide matrix of central tolerance in the human thymus. Nature Communications. , (2013).
