Isolamento di cellule dendritiche mieloidi e cellule epiteliali di timo umano
Summary
Dettagli Questo protocollo un metodo per isolare le cellule presentanti l'antigene da timo umano attraverso diverse fasi di digestione enzimatica del tessuto seguita dalla densità centrifugazione della sospensione di cellule singole e smistamento finalmente magnetico e / o FACS delle popolazioni cellulari di interesse.
Abstract
In questo protocollo forniamo un metodo per isolare le cellule dendritiche (DC) e cellule epiteliali (TEC) dal timo umano. DC e TEC sono i principali cellule presentanti l'antigene (APC) tipi trovato in un timo normale ed è ben stabilito che essi svolgono ruoli distinti durante la selezione del timo. Queste cellule sono localizzate in microambienti distinti nel timo e ogni tipo APC rappresenta soltanto una frazione minore di cellule. Per capire meglio la biologia di questi tipi cellulari, caratterizzazione di queste popolazioni cellulari è altamente auspicabile, ma a causa della loro bassa frequenza, l'isolamento di uno qualsiasi di questi tipi cellulari richiede una procedura efficiente e riproducibile. Dettagli Questo protocollo un metodo per ottenere cellule adatte per la caratterizzazione di diverse proprietà cellulari. Tessuto timico è interrotta meccanicamente e dopo diverse fasi di digestione enzimatica, la sospensione cellulare risultante è arricchito con un passo centrifugazione densità Percoll. Per l'isolamento di DC mieloidi (CD11c <sup> +), le cellule della frazione a bassa densità (LDF) sono immunoselected da cell sorting magnetico. Arricchimento delle popolazioni TEC (MTEC, CTEC) si ottiene l'esaurimento delle emopoietiche (CD45 hi), le cellule dalla frazione di cellule Percoll a bassa densità che consente loro successivo isolamento tramite fluorescenza delle cellule attivate (FACS) utilizzando marcatori cellulari specifici. Le cellule isolate possono essere utilizzati per diverse applicazioni a valle.
Introduction
Il timo è l'organo in cui avviene lo sviluppo delle cellule T. La sua dimensione relativa e assoluta diminuisce con l'età, quando viene successivamente sostituito da grasso, anche se l'attività del timo può ancora essere rilevata in età avanzata. La sua importanza per la risposta immunitaria è stata dimostrata nei primi anni del 1960 1.
Il repertorio di cellule T è sagomata attraverso l'interazione di recettori delle cellule T con complessi peptide-MHC su diversi tipi di timica APC, che forniscono sopravvivenza o morte spunti per sviluppare cellule T, risultando in un repertorio di cellule T e funzionale gran parte auto-tolerant 2.
Circa il 98% delle cellule nel timo umano stanno sviluppando cellule T denominate timociti. Il restante 2% è costituito da un certo numero di diversi tipi di cellule, tra cui una varietà di TEC (corticale, midollare, sottocapsulare), mieloidi e DC plasmacitoidi (MDC, PDC), macrofagi, cellule B, cellule T a ricircolo maturi, granulociti, fibroblasts, cellule endoteliali e cellule epiteliali molto rare attraverso una espressione fenotipo simile a quello di cellule di altri tessuti come i muscoli, neuroni e epitelio respiratorio (Figura 1). Di questi, TEC e DC sono i principali tipi APC trovato in un timo normale. Negli ultimi anni, la purificazione di questi tipi di APC per la cultura e profiling molecolare ha guadagnato sempre più interesse. A causa della loro bassa frequenza, l'isolamento di uno qualsiasi di questi tipi di cellule per l'analisi dettagliata richiede una procedura efficiente, riproducibile e conveniente. Il metodo qui presentato è una modifica da studi pubblicati in precedenza 3,4.
Come con qualsiasi altro tessuto, estrazione cella dal timo può essere ottenuto enzimaticamente disaggregando cellula-cellula e reti di interazione cellula-matrice, in modo da ottenere una sospensione di cellule singole. Ci sono alcuni parametri come la buona efficienza di dissociazione, il rendimento delle cellule, vitalità cellulare e la conservazione delle cellule smarcatori urface che sono cruciali e devono essere ottimizzati per l'isolamento di successo di queste popolazioni di cellule rare.
In questo protocollo, isolamento di DC e sottoinsiemi TEC viene eseguita facendo una cella singola sospensione del tessuto tramite rottura meccanica e digestione enzimatica. Usiamo Collagenase A da Clostridium histolyticum, che ha un rapporto equilibrato di diverse attività enzimatiche, per abbattere il collagene nativo che tiene il tessuto insieme. DNasi I è incluso nella soluzione enzimatica di ridurre l'aggregazione delle cellule a causa di DNA libero da cellule morte (timociti sono molto sensibili). Forniamo anche un approccio alternativo al tipico tessuto digestione enzimatica comporta il trattamento dei tessuti meccanica ed enzimatica assistito da un dissociatore tessuto. La sospensione singola cella viene quindi sottoposto ad una singola densità centrifugazione Percoll per l'arricchimento della frazione a bassa densità (LDF) di cellule. Da questa frazione di cellule, DC può essere isolato mediante colorazione fo marcatori DC-superficie (cioè CD11c +) e usando la separazione magnetica o cella fluorescenza-attivato (FACS). A differenza delle cellule linfoidi comprendenti la stragrande maggioranza delle cellule nel timo, TEC non esprimono CD45 ad alti livelli, ma sono positivi per l'adesione delle cellule epiteliali molecola EpCAM. CTEC può essere distinto dal TEC midollare mediante l'espressione di un antigene ancora indefinito riconosciuto dalla CDR-2 (corticale dendritico reticolociti-2) anticorpo 4,5 e espressione EpCAM leggermente inferiore. Il differenziale co-espressione di EpCAM e CDR2 permette l'isolamento efficiente di questi sottoinsiemi TEC via cellulare ad alta velocità smistamento 6.
Il protocollo qui presentato è ottimizzato per tessuto timico umano. La durata della procedura dipende dalla quantità di tessuto e la capacità dello sperimentatore così come la velocità del cell sorter, se viene utilizzato FACS ordinamento. Normalmente, il protocollo per l'isolamento di CC può essere completato entro 5-6 Hr e per l'isolamento di TCE in 8-10 ore. L'isolamento della DC e sottoinsiemi TEC dal tessuto timico è momento delicato. Il più veloce la procedura di isolamento, migliore la condizione delle cellule. Infine, le cellule isolate possono essere utilizzati per ulteriori indagini come studi comparativi di mRNA e l'espressione della proteina, esperimenti di PCR, isolamento delle proteine, profiling molecolare (cioè transcriptomics, analisi micro RNA) e coltura cellulare 6.
Dichiarazione Etica
Al fine di poter lavorare con il tessuto del timo umano il ricercatore deve ottenere l'approvazione del comitato etico locale o autorità responsabili, nonché un consenso informato scritto del donatore (o di solito i suoi genitori, poiché il tessuto è di solito ottenuto da minorenni bambini). Inoltre, tutti i tessuti umani devono essere trattati come dovrebbero essere adottate misure potenzialmente infettivi ed appropriate, come ad esempio lavorare con i guanti, ecc.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto è una modifica del protocollo pubblicato da Gotter et al 4. Fasi critiche nel protocollo sono la condizione e la preparazione iniziale del tessuto e la separazione densità Percoll. Si consiglia vivamente di trattare il tessuto il più presto possibile dopo la raccolta. È importante lavorare velocemente ma accuratamente durante la pulizia e il taglio del tessuto. Durante il lavaggio timociti descritto al punto 2.3, è fondamentale trovare il giusto equilibrio quando si a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati ai chirurghi del Dipartimento di Chirurgia Toracica e Cardiovascolare, Clinica universitaria di Tubinga per averci fornito i campioni di timo e Bruno Kyewski (DKFZ, Heidelberg, Germania) per fornire l'anticorpo CDR2. Vorremmo anche ringraziare Hans-Jörg Bühring e Sabrina Grimm dalla struttura di smistamento (Università di Tubinga). Questo lavoro è stato supportato dal SFB 685 e la Fondazione Hertie.
Materials
| Reagents and Materials | |||
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| Dulbecco's PBS | PAA | H15-002 | |
| Fetal Bovine Serum-Gold | PAA | A15-151 | |
| Bovine Serum Albumin | PAA | K41-001 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | |
| DNase I, grade II bovine pancreatic | Roche | 10 104 159 001 | |
| Trypsin-EDTA 10x in PBS | PAA | L11-001 | stock conc. 20 mg/ml |
| Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit | Molecular Probes | A-10235 | |
| anti-human CDR2 (purified) | Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany | labeled with Alexa Fluor 488 | |
| anti-human CD45 (Pacific Blue) | Biolegend | 304022 | |
| anti-human EpCAM (APC) | Miltenyi Biotec | 130-091-254 | |
| anti-human CD11c (PE) | Miltenyi Biotec | 130-092-411 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| anti-CD45 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for tissue dissociator |
| Percoll (density 1.130 g/ml) | GE Healthcare, Life Sciences | 17-0891-01 | |
| Sterile distilled Water (DNAse/ RNAse free) | GIBCO | 10977-035 | |
| Gamunex 10% | Tajecris-Biotherapeutics | G120052 | 1:10 pre-dilution, use 20 μl/1 x 106cells |
| 0.22 μm filter | Millex GS | SLGS033SS | Syringe driven |
| Stericup filter unit | Millipore | SCGPU05RE | Pump driven |
| 50 ml PC oak ridge centrifuge tubes | Nalgene | 3118-0050 | 50 ml |
| 50 ml PP conical tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| 12 mm x 75 mm 5 ml test tubes | Becton Dickinson | 352058 | FACS stainings |
| Cell strainer 70 μm | Becton Dickinson | 352350 | |
| INSTRUMENTS | |||
| Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu) | Becton Dickinson | ||
| Sorvall Evolution R6 (rotor) | Kendro | ||
| Rotator REAX 2 | Heidolph | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093 235 | tissue dissociator |
References
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