İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu
Summary
Bu protokol, antijen yoğunluğuna tek bir hücre süspansiyonu santrifüj ve ilgi hücre popülasyonlarının son olarak manyetik ve / veya FACS ayıklama, ardından doku enzimatik sindirimi farklı adımları ile insan timus hücreleri sunan izole etmek için bir yöntem göstermektedir.
Abstract
Bu protokolde, insan timus dendritik hücreler (DC) ve epitel hücreleri (TEC) izole etmek için bir yöntem sağlar. DC ve TEC büyük antijen sunan hücre normal timus bulundu (APC) türleri vardır ve iyi onlar timus seçimi sırasında farklı rolleri oynadığı kurulmuştur. Bu hücreler, timus ayrı mikroçevrelerde lokalize ve her APC tür hücrelerin sadece küçük bir popülasyonu oluşturan vardır. Bundan başka, bu hücre tiplerinin biyolojisi anlamak için, bu hücre popülasyonlarının tanımlanması oldukça tercih edilir ama nedeniyle düşük bir frekansa, bu hücre tiplerinin herhangi birinden izolasyonu etkili ve yeniden üretilebilir bir prosedürü gerektirir. Bu protokol, çeşitli hücresel özellikleri karakterizasyonu için uygun hücrelerin elde edilmesi için bir yöntem göstermektedir. Timus doku mekanik olarak bozulur ve enzimatik sindirme farklı adımları sonra, elde edilen hücre süspansiyonu bir Percoll yoğunluk santrifüjleme aşaması kullanılarak zenginleştirilmiştir. Miyeloid DC (CD11c'nin izolasyonu için <sup> +), düşük yoğunluklu kısmıyla (LDF) gelen hücreler, manyetik hücre sıralama ile immunoselected edilir. TEC popülasyonlar (MTec, CTEC) zenginleştirilmesi spesifik hücre markörleri kullanılarak (FACS) floresan aktive hücre aracılığı ile daha sonra izole edilmesini sağlayan düşük yoğunluklu Percoll hücre fraksiyonundan hematopoietik (CD45 hi) hücrelerinin tükenmesi ile elde edilir. Izole edilmiş hücreler, farklı alt uygulamalar için kullanılabilir.
Introduction
Timus T hücresi gelişme cereyan ettiği bir organdır. Timik aktivitesi hala yaşlılıkta tespit edilebilir, ancak bu durumda sürekli olarak yağ ile ikame olur zaman onun nispi ve mutlak büyüklüğü yaşla birlikte azalır. Immün tepkisi için önemi 1960'ların 1 'de gösterilmiştir.
T hücresi işlevsel bir repertuar ve büyük ölçüde kendi kendine dayanıklı T hücresi repertuarının 2 ile sonuçlanan T hücrelerinin gelişmekte olan hayatta kalma ya da ölüm ipuçları sağlamak timik APC farklı ilgili MHC-peptid kompleksleri ile T hücresi reseptörlerinin etkileşimi yoluyla şekillenir.
Insan timus hücrelerin yaklaşık% 98 timositlerde olarak adlandırılan T hücreleri geliştirmektedir. Geriye kalan,% 2, bir TEC çeşitli (kortikal, medüller, subkapsüler), miyeloid ve plazmasitoid DC (MDC, pDC), makrofajlar, B hücreleri, olgun yeniden dolaşan T hücreleri, granülositler gibi farklı hücre tipleri, bir dizi oluşmaktadır fbir ekspresyon fenotipli ibroblasts, endotelyal hücrelerin ve çok nadir epitel hücreleri, kas, nöronlar ve solunum yolu epitel gibi diğer dokuların (Şekil 1) gelen hücre benzeyen. Bunlardan, TEC ve DC normal timus bulunan başlıca APC türleridir. Son yıllarda, kültür ve moleküler profili çıkartmak için, bu tip APC saflaştırılması daha fazla ilgi görmüştür. Nedeniyle düşük bir frekansa, ayrıntılı analiz için, bu hücre tiplerinin herhangi birinin izolasyonu etkin, tekrarlanabilir ve maliyet-etkin bir prosedürü gerektirir. Burada sunulan yöntem, daha önce yayınlanmış çalışmalar 3,4 'den bir modifikasyonudur.
Başka bir doku gibi, timüs hücre ekstre enzimatik olarak tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için, hücre-hücre ve hücre-matris etkileşim ağları ayırmak ile elde edilebilir. Iyi ayrışma verimliliği, hücre verimi, hücre canlılığı ve hücre s tutma gibi bazı parametreler vardırönemli olan ve sert bir yere belirteçler bu nadir hücre popülasyonlarının başarılı bir şekilde izole edilmesi için optimize edilmesi gerekir.
Bu protokol, DC ve alt-TEC izolasyonu mekanik parçalama ve enzimatik sindirme ile doku tek hücre süspansiyonu yaparak gerçekleştirilir. Biz doku bir arada tutan yerli kolajen yıkmak için, farklı enzim aktiviteleri dengeli bir orana sahiptir Clostridium histolyticum'dan, gelen Kolajenaz A kullanın. DNase I (timositleri çok hassastır). Ayrıca bir doku ayrıştırıcı yardımıyla mekanik ve enzimatik doku tedavi ile ilgili tipik bir enzimatik Doku sindirimi için alternatif bir yaklaşım sağlar nedeniyle ölü hücrelerden serbest DNA hücre agregasyonunu azaltmak için enzim çözeltisi dahildir. Tek hücre süspansiyonu daha sonra hücre düşük yoğunluklu kısmıyla (LDF) zenginleştirilmesi için tek bir Percoll yoğunluk santrifüj işlemine tabi tutulur. Hücrelerin bu fraksiyondan DC f boyama izole edilebilirya da DC-yüzey belirteçleri (örneğin, CD11c +) ve manyetik ayırma veya floresan aktive hücre sınıflandırma (FACS) kullanılarak. Timus hücrelerin büyük bir çoğunluğu içeren lenfoid hücrelerinin aksine, TEC yüksek seviyelerde CD45 eksprese ancak epitelyal hücre yapışma molekülü EpCAM pozitif olan yoktur. CTEC CDR-2 (kortikal dendritik retikülosit-2) antikoru 4,5 ve daha düşük EpCAM ifadesi tarafından tanınan bir henüz tanımlanmamış antijeninin ekspresyonu ile medüller TEC ayırt edilebilir. Diferansiyel EpCAM ve CDR2 eş ifadesi, yüksek hızlı bir hücre ile bu alt-TEC etkin yalıtım 6 ayırma sağlar.
Burada sunulan protokol, insan timus dokusu için optimize edilmiştir. FACS kullanılması halinde, prosedürün süresi, doku miktarı ve deneyi yeteneği hem de hücre sıralayıcı hızına bağlıdır. Normal olarak, DC izolasyonu için protokol 5 içinde tamamlanabilir-6 Hr ve 8-10 saat içinde TEC izolasyonu için. Timik doku DC ve TEC altkümelerin izolasyon zaman duyarlı. Daha hızlı izolasyon prosedürü, hücrelerin durumu daha iyi. Son olarak, izole edilmiş hücreler mRNA karşılaştırmalı çalışmalar ve protein ifadesi, PCR deneyleri, protein izolasyon, moleküler profili (yani transkriptomik, mikro RNA analizi) yanı sıra hücre kültürü 6 gibi daha ileri araştırmalar için de kullanılabilir.
Etik Bildirimi
Insan timus dokusu ile çalışmak edebilmek amacıyla araştırmacı doku genellikle reşit elde beri yerel etik kurul veya sorumlu makamlar yanı sıra donörün bilinçli bir yazılı izni (ya da genellikle kendi anne, onay almak gerekiyor çocuklar). Ayrıca, tüm insan dokuları potansiyel bulaşıcı ve uygun önlemlerin vb, eldiven ile çalışma gibi, alınmalıdır olarak ele alınmalıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol Götter ve arkadaşları tarafından yayımlanan 4 protokol bir modifikasyonudur. Protokolde kritik adım durumu ve doku ilk hazırlanması hem de Percoll yoğunluk ayrılması bulunmaktadır. Önemle kısa sürede toplandıktan sonra doku işlemek için tavsiye. Bu temizlik ve doku keserken hızlı ama iyice çalışmak önemlidir. Adım 2.3 'de tarif edilen timosit yıkama sırasında, stromal hücrelere zarar verebilir çok güçlü ve uzun süreli basınç doku par…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz CDR2 antikorun sağlanması için timus örnekler ve Bruno Kyewski (DKFZ, Heidelberg, Almanya) ile bize sağlamak için Göğüs Kalp ve Damar Cerrahisi Anabilim Dalı, Üniversite Kliniği Tuebingen cerrahlar için minnettarız. Biz de sıralama tesisinin (Tübingen Üniversitesi) Hans-Jörg Bühring ve Sabrina Grimm teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma SFB 685 ve hertie Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Reagents and Materials | |||
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| Dulbecco's PBS | PAA | H15-002 | |
| Fetal Bovine Serum-Gold | PAA | A15-151 | |
| Bovine Serum Albumin | PAA | K41-001 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | |
| DNase I, grade II bovine pancreatic | Roche | 10 104 159 001 | |
| Trypsin-EDTA 10x in PBS | PAA | L11-001 | stock conc. 20 mg/ml |
| Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit | Molecular Probes | A-10235 | |
| anti-human CDR2 (purified) | Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany | labeled with Alexa Fluor 488 | |
| anti-human CD45 (Pacific Blue) | Biolegend | 304022 | |
| anti-human EpCAM (APC) | Miltenyi Biotec | 130-091-254 | |
| anti-human CD11c (PE) | Miltenyi Biotec | 130-092-411 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| anti-CD45 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for tissue dissociator |
| Percoll (density 1.130 g/ml) | GE Healthcare, Life Sciences | 17-0891-01 | |
| Sterile distilled Water (DNAse/ RNAse free) | GIBCO | 10977-035 | |
| Gamunex 10% | Tajecris-Biotherapeutics | G120052 | 1:10 pre-dilution, use 20 μl/1 x 106cells |
| 0.22 μm filter | Millex GS | SLGS033SS | Syringe driven |
| Stericup filter unit | Millipore | SCGPU05RE | Pump driven |
| 50 ml PC oak ridge centrifuge tubes | Nalgene | 3118-0050 | 50 ml |
| 50 ml PP conical tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| 12 mm x 75 mm 5 ml test tubes | Becton Dickinson | 352058 | FACS stainings |
| Cell strainer 70 μm | Becton Dickinson | 352350 | |
| INSTRUMENTS | |||
| Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu) | Becton Dickinson | ||
| Sorvall Evolution R6 (rotor) | Kendro | ||
| Rotator REAX 2 | Heidolph | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093 235 | tissue dissociator |
References
- Miller, J. F. A. P. The discovery of thymus function and of thymus-derived lymphocytes. Immunological Reviews. 185, 7-14 (2002).
- Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat Rev Immunol. 9, 833-844 (2009).
- Vandenabeele, S., Hochrein, H., Mavaddat, N., Winkel, K., Shortman, K. Human thymus contains 2 distinct dendritic cell populations. Blood. 97, 1733-1741 (2001).
- Gotter, J., Brors, B., Hergenhahn, M., Kyewski, B. Medullary Epithelial Cells of the Human Thymus Express a Highly Diverse Selection of Tissue-specific Genes Colocalized in Chromosomal Clusters. The Journal of Experimental Medicine. 199, 155-166 (2004).
- Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 36, 1511-1517 (1988).
- Stoeckle, C., et al. Cathepsin S dominates autoantigen processing in human thymic dendritic cells. Journal of Autoimmunity. 38, 332-343 (2012).
- Woods Ignatoski, K. M., Bingham, E. L., Frome, L. K., Doherty, G. M. Directed trans-differentiation of thymus cells into parathyroid-like cells without genetic manipulation. Tissue Eng Part C Methods. 17, 1051-1059 (2011).
- Williams, K. M., et al. Single Cell Analysis of Complex Thymus Stromal Cell Populations: Rapid Thymic Epithelia Preparation Characterizes Radiation Injury. Clinical and Translational Science. 2, 279-285 (2009).
- Bendriss-Vermare, N., et al. Human thymus contains IFN-α-producing CD11c-, myeloid CD11c+, and mature interdigitating dendritic cells. The Journal of Clinical Investigation. 107, 835-844 (2001).
- Schmitt, N., et al. Ex vivo characterization of human thymic dendritic cell subsets. Immunobiology. 212, 167-177 (2007).
- Dzionek, A., et al. BDCA-4: Three Markers for Distinct Subsets of Dendritic Cells in Human Peripheral Blood. The Journal of Immunology. 165, 6037-6046 (2000).
- Wu, L., Shortman, K. Heterogeneity of thymic dendritic cells. Seminars in Immunology. 17, 304-312 (2005).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of Immunological Methods. 385, 23-34 (2012).
- Adamopoulou, E., Tenzer, S., Hillen, N., Klug, P., Rota, I. A., Tietz, S., Gebhardt, M., Stevanovic, S., Schild, H., et al. Exploring the MHC-peptide matrix of central tolerance in the human thymus. Nature Communications. , (2013).
