En qPCR analysen ble utviklet for påvisning av Escherichia coli O157: H7 målretting en unik genetisk markør, Z3276. QPCR ble kombinert med propidium monoazide (PMA) behandling for levende celle gjenkjenning. Denne protokoll er blitt modifisert og tilpasset til en 96-brønn plate-format for enkel og jevn behandling av mange prøver
En unik åpen leseramme (ORF) Z3276 ble identifisert som en spesifikk genetisk markør for E. coli O157: H7. En qPCR assay ble utviklet for påvisning av E. coli O157: H7 ved å målrette ORF Z3276. Med denne måling kan vi påvise så lite som noen få kopier av genomet av DNA av E. coli O157: H7. Sensitiviteten og spesifisiteten av analysen ble bekreftet ved intensiv valideringstester med et stort antall E. coli O157: H7 stammer (n = 369) og ikke-O157 stammer (n = 112). Videre har vi kombinert propidium monoazide (PMA) prosedyre med den nyutviklede qPCR protokoll for selektiv påvisning av levende celler fra døde celler. Amplifikasjon av DNA fra PMA-behandlede døde celler ble nesten fullstendig hemmet, i motsetning til praktisk talt upåvirket amplifisering av DNA fra PMA-behandlede levende celler. I tillegg har den protokoll er modifisert og tilpasset til en 96-brønn plate-format for en lett og jevn behandling av et stort antall prøver. Thans metode er forventet å ha en innvirkning på nøyaktig mikrobiologiske og epidemiologiske overvåking av matvaresikkerhet og miljø kilde.
PCR er en vanlig teknikk for påvisning av E. coli O157: H7 fra mat og miljøprøver. Identifisere spesifikke biomarkører for E. coli O157: H7 er en av de viktigste faktorene for vellykket deteksjon i PCR-analyser. De biomarkører som vanligvis brukes i PCR-analyser for påvisning av E. coli O157: H7 er Shiga toksiner (STX 1 og STX 2) 1,2, uidA 3,4, eaeA 5,6, rfbE 7, og Flic gener 8,9. Disse biomarkører kan gi varierende effektivitet for identifikasjon, men da kan det meste av biomarkører ikke brukes som en unik biomarkør for deteksjon av E. coli O157: H7. Dette utilstrekkelighet i differensiering kraft målgener krever mer spesifikke og sterkere biomarkør (er) for identifisering av E. coli O157: H7 10.
Tallrike prober for gener eller hypotetiske åpne leserammer (ORF'er) i E. coliO157: H7 11 ble designet for qPCR analysen basert på ledetråder fra DNA genotyping mikromatriser fra vårt laboratorium og ved å søke innenfor GenBank database av National Center for Biotechnology Information. Sekvensen av Z3276 ORF, som er en fimbrial gen 11, ble valgt for qPCR assay. Deretter ble en qPCR assay utviklet gjennom tallrike forsøk på PCR-parametere som for eksempel konsentrasjon av primere og prober, samt annealing og forlengelsestemperatur (data ikke vist). Etter insentiv inclusivity og eksklusivitet tester på referansestammer som E. coli O157: H7, non-O157 og Shigella-stammer i qPCR ble ORF Z3276 identifisert som en spesiell og sterk genetisk markør for identifisering av E. coli O157: H7. Deretter utvikler vi en ny qPCR metode å bruke denne unike biomarkør for identifisering av E. coli O157: H7.
En annen utfordring i påvisning av E. coli O157: H7 i forurenset foods og miljø er nøyaktig bestemmelse av levende celler fra prøvene. Den utvidede tilstedeværelse av DNA fra døde celler og manglende evne til å skille levedyktighet i PCR-analyse kan føre til falske positive resultater, noe som resulterer i overvurdering av levende celle tall i deteksjon. Derfor begrenser denne bruken PCR i nøyaktig påvisning av matbårne patogener 12. En ny tilnærming til å skille DNA av de døde cellene har blitt tatt ved å kombinere propidium monoazide (PMA) behandling med PCR prosedyre i de siste årene 13-15. PMA er i stand til å gå inn i døde celler, og intercalate i DNA når de utsettes for lys, men den kan ikke gå på innsiden av levende celler til å reagere med DNA av de levende celler. Således, i PMA-behandlede blandinger av levende og døde celler, DNA av døde celler kan ikke bli forsterket i PCR 13. Vi kombinerte PMA behandling med den nyutviklede qPCR analyse for å selektivt påvise levende E. coli O157: H7 celler. I tillegg har vi gjort PMA-qPCR enssay mulig for høy gjennomstrømning deteksjon.
Et hovedmål med studien innebærer bruk av en ORF Z3276, en unik for E. coli O157: H7, som en eneste biomarkør for qPCR analysen. I dag er de fleste qPCR analyser rettet virulens gener, for eksempel stx1, stx2, og eaeA 1,2,5,6 eller delte fenotypiske gener, for eksempel uidA 3,4, rfbE og Flic gener 8,9. Av og til, en art eller stamme kan ikke definitivt identifisert av virulens-genet (er), for eksempel 1 og STX STX to gener, så disse gener er til stede i forskjellige arter eller stammer 16 i tillegg. Ved hjelp av rfbE og FLIC for målgener, er begge gener som er nødvendig for å bli brukt til fullstendig identifisering 17.. Ved hjelp av ORF Z3276 som en biomarkør, har dette qPCR analyse vist seg å være sensitiv og spesifikk analyse (tabell 1). Denne analysen har vært utsatt for strenge inclusivity og eksklusivitet tester, inkludert O157: H7 stammer (n = 367), over 100 ikke-O157-stammer, og andre patogene arter, slik som Salmonella og Shigella. Alle O157: H7 stammer undersøkt ble positivt oppdaget, og ingen kryss-reaktivitet ble funnet fra de ikke-O157 stammer (Tabell 1), noe som indikerer at ORF Z3276 er en unik og sterk biomarkør for påvisning av E. coli O157: H7.
Den andre Målet med studien er å selektivt detektere levende celler fra døde celler ved PMA behandling før DNA-ekstraksjon. PMA kan trenge inn i de døde celler med nedsatt membran og binder seg til DNA, og således inhiberer DNA-amplifiseringen av døde celler i PCR 13. Vi har modifisert PMA-behandling prosedyre, og er tilpasset det til en 96-brønn plate-format for prosedyren. Den riktige intensitet lyseksponering er nødvendig for å oppnå optimal tverrbinding i kraft. Tidligere har mikrorør blitt brukt i dette trinnet 13-15. Imidlertid separate mikrorør er vanskelige å håndtere i lys exposure trinn, og i disse rør ikke er helt gjennomsiktig for å oppnå best tverr smak. Ved hjelp av en 96-brønns plate, forbedret vi effektiviteten av PMA-behandling. Disse endringene kan påvirke analysen på flere måter: de gjør det lettere å oppnå en grundig, ensartet tverrbindingseffekt, særlig med en rekke prøver, har de behandlede prøvene kan flyttes fra en plate til en annen for å gjøre det mulig for påvisning av mange av prøvene, og de gir denne PMA-qPCR analysen med automatisering potensial for hele prosessen. Begrensningen av denne PMA-qPCR analysen er at PMA behandling øker PCR analysen kostnadene noe, og litt redusert følsomhet for PCR-analyse.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker det amerikanske Department of Homeland Security for å gi en del av finansieringen.
AB 7900HT Fast Real-time PCR system | ABI | ||
2 x Universal master mix | ABI | 4304437 | |
PrepMan Ultra | ABI | 4318930 | |
Primer Express | ABI | ||
Probes | ABI | Top of Form | |
4316033 Bottom of Form | |||
PMA | Biodium | 40013 | |
Puregen cell and tissue kit | Qiagene | Top of Form | |
158622 | |||
Bottom of Form | |||
DU530 spectrophotometer | Beckman | ||
Spectrophotometer | NanoDrop Technology | ND-1000 | |
650 w halogen light source | Britek | H8061S | |
Otptical Adhesive film | ABI | 4311971 | |
Optical 96-well reaction plate | ABI | 4316813 |