) 1 से सेलुलर लिपिड बूंदों अलग खमीर कोशिकाओं और 2) मानव placentas प्रस्तुत कर रहे हैं के लिए दो तकनीकों. दोनों प्रक्रियाओं के केंद्र बूंदों से युक्त जिसके परिणामस्वरूप चल परत आसानी से, आँख द्वारा कल्पना निकाला, और पवित्रता के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, जहां घनत्व ढाल centrifugation है.
लिपिड बूंदों सबसे यूकेरियोटिक और कुछ prokaryotic कोशिकाओं में पाया जा सकता है कि गतिशील organelles हैं. Structurally, बूंदों एक फॉस्फोलिपिड monolayer से घिरे तटस्थ लिपिड का एक कोर से मिलकर बनता है. बूंदों के सेलुलर भूमिकाओं का निर्धारण करने में सबसे उपयोगी तकनीकों में से एक बूंदों के साथ अलग किया जा सकता है, जो बाध्य प्रोटीन की प्रोटिओमिक पहचान की गई है. विखंडन खमीर और मानव अपरा विलस कोशिकाओं: यहाँ, दो तरीकों दो व्यापक यूकैर्योसाइटों से लिपिड बूंदों और उनके बाध्य प्रोटीन को अलग करने वर्णित हैं. दोनों तकनीकों मतभेद हैं हालांकि, मुख्य विधि – घनत्व ढाल centrifugation – दोनों की तैयारी द्वारा साझा किया जाता है. इस प्रस्तुत छोटी बूंद अलगाव तकनीक का व्यापक प्रयोज्यता पता चलता है.
पहली प्रोटोकॉल में, खमीर कोशिकाओं अपने सेल दीवारों के enzymatic पाचन द्वारा स्फेरोप्लास्ट में परिवर्तित कर रहे हैं. परिणामस्वरूप स्फेरोप्लास्ट तो सज्जन कर रहे हैंly एक ढीले ढाले homogenizer में lysed. Ficoll एक घनत्व ढाल प्रदान करने के लिए lysate में जोड़ा जाता है, और मिश्रण तीन बार centrifuged है. पहली स्पिन के बाद, लिपिड बूंदों जालिका (ईआर), प्लाज्मा झिल्ली, और vacuoles के साथ अपकेंद्रित्र ट्यूबों का सफेद रंग का अस्थायी परत के लिए स्थानीय कर रहे हैं. दो बाद spins इन तीन अन्य अंगों को निकालने के लिए उपयोग किया जाता है. परिणाम केवल बूंदों और बाध्य प्रोटीन है कि एक परत है.
दूसरा प्रोटोकॉल में, अपरा विलस कोशिकाओं trypsin और DNase मैं कोशिकाओं को एक ढीले ढाले homogenizer में homogenized हैं साथ enzymatic पाचन द्वारा मानव अवधि placentas से अलग कर रहे हैं. कम गति और मध्यम गति centrifugation कदम अटूट कोशिकाओं, सेलुलर मलबे, नाभिक, और mitochondria दूर करने के लिए उपयोग किया जाता है. सुक्रोज एक घनत्व ढाल प्रदान करने के लिए homogenate में जोड़ा जाता है और मिश्रण अन्य सूक्ष्मकोशिका से लिपिड बूंदों अलग करने के लिए centrifuged हैआर भिन्न.
दोनों प्रोटोकॉल में लिपिड बूंदों की पवित्रता पश्चिमी धब्बा विश्लेषण करके इसकी पुष्टि की है. दोनों preps से छोटी बूंद भिन्न बाद प्रोटिओमिक और lipidomic विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं.
सेलुलर लिपिड बूंदों कोशिकाओं में कई कार्यों की सेवा है कि गतिशील organelles हैं. वे ऊर्जा में परिवर्तित या फॉस्फोलिपिड संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो तटस्थ लिपिड, के लिए भंडारण केन्द्र हैं. बूंदों atherosclerosis, मोटापा और संबंधित चयापचय रोगों सहित शारीरिक और रोग की स्थिति में केंद्रीय भूमिका निभाने, और भी संक्रामक रोगों 1,2. इसके अलावा, वे biodiesel ईंधन के लिए साज़िश का स्रोत हैं.
लिपिड बूंदों के सेलुलर भूमिकाओं पर ज्यादा जानकारी व्यापक जीवों 3 से शुद्ध बूंदों की प्रोटिओमिक और lipidomic विश्लेषण से प्राप्त किया गया है. इन जीवों, बैक्टीरिया 4,5, खमीर 6-11 शामिल 12,13 संयंत्र, 14 नेमाटोड, और 15,16 मक्खियों है. मानव चयापचय रोगों में लिपिड बूंदों की भूमिका में रुचि को देखते हुए, बूंदों भी सभ्य पशु कोशिकाओं और एक से पृथक किया गया हैनिमल ऊतकों. सभ्य सेल लाइनों 3T3-एल 1 adipocytes 17, चीनी हम्सटर अंडाशय (चो) K2 कोशिकाओं 18, मानव hepatocyes 19,20, और उपकला कोशिका लाइनों 21 को शामिल किया है. बूंदों पृथक किया गया है जिसमें से जानवरों के ऊतकों माउस कंकाल की मांसपेशी 22, जिगर 23, और स्तन ग्रंथियों 23 को शामिल किया है. जैसा कि ऊपर कहा, सबसे छोटी बूंद अलगाव पढ़ाई के लक्ष्य के लिए बाध्य कारकों और तटस्थ और phospholipids पर lipidomic विश्लेषण पर प्रोटिओमिक विश्लेषण करने के लिए है.
तटस्थ लिपिड के बाद से – लिपिड बूंदों की सबसे अनेक घटक – सबसे अन्य सेलुलर सामग्री की तुलना में कम घने हैं, बूंदों के अलगाव पारंपरिक रूप से घनत्व ढाल centrifugation का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है. यही तकनीक यहाँ प्रस्तुत दोनों preps के केंद्र में है. पिछले तकनीकों 6,24 सुसंस्कृत विखंडन खमीर कोशिकाओं से बूंदों के अलगाव का एक दृश्य प्रस्तुति में संयुक्त और संशोधित कर रहे हैंऔर noncultured मानव कोशिकाओं अपरा ऊतक से प्राप्त की. लक्ष्य छोटी बूंद अलगाव के लिए अंक शुरू करने के रूप में दो बेहद अलग प्रकार की कोशिकाओं को चुनकर इस तकनीक का व्यापक प्रयोज्यता दिखाने के लिए है. इस तकनीक को सबसे जीवों से बूंदों को अलग करने के इच्छुक लोगों के लिए उपयोगी होना चाहिए.
प्रोटोकॉल 1 यूकेरियोटिक कोशिका विभाजन 25 के दौरान छोटी बूंद गठन के अवलोकन के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है जो विखंडन खमीर, Schizosaccharomyces pombe, से लिपिड बूंदों के अलगाव का वर्णन करता है. नवोदित खमीर लिपिड छोटी बूंद जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में जीव बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है. प्रोटोकॉल 1 जीवों और तैयारी में मतभेद दोनों पर लागू होता है डाला जाता है.
प्रोटोकॉल 2 मानव अवधि placentas से प्राप्त बारी में हैं जो अपरा विलस कोशिकाओं से लिपिड बूंदों के अलगाव का वर्णन करता है.अवधि placentas का संग्रह सुरक्षित और नैतिकता की दृष्टि से लिपिड बूंदों की बड़ी संख्या शामिल है, जो आसानी से उपलब्ध मानव ऊतक 26 की 200-250 ग्राम प्राप्त करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है. इस बूंदों संवर्धित कोशिकाओं से उत्पन्न जहां उच्च eukaryotes में सबसे लिपिड छोटी बूंद अलगाव काम के विपरीत है. उन अध्ययनों में, फैटी एसिड अक्सर तटस्थ लिपिड और इस तरह बूंदों के विकास के संश्लेषण को बढ़ावा देने के लिए संस्कृति को जोड़ रहे हैं. इस लिपिड बूंदों अपरा ऊतक में देशी परिस्थितियों में गठन कर रहे हैं जहां यहां काम के विपरीत है.
लिपिड छोटी बूंद अंशों की purities organelle मार्कर एंटीबॉडी का उपयोग पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा निर्धारित कर रहे हैं. इन दो प्रोटोकॉल बाद प्रोटिओमिक और lipidomic विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं कि लिपिड छोटी बूंद भिन्न निकलेगा.
इस प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
संवर्धित कोशिकाओं के विकास के दौरान मीडिया और सेल घनत्व के अनुरूप होना सुनिश्चित करें. सेलुलर लिपिड बूंदों उनके जुड़े प्रोटीन कोशिकाओं ?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम के पीडी को पीडी को अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन पुरस्कार 13SDG14500046, एक सतत ऊर्जा शिक्षा एवं रिसर्च सेंटर अवार्ड (टेनेसी Univ.) द्वारा समर्थित है, और जेएम को 'डॉक्टरों चिकित्सा शिक्षा एवं अनुसंधान फाउंडेशन (टेनेसी Univ.) द्वारा पुरस्कार दिया गया था उसकी मिलाते इन्क्यूबेटरों, tabletop अपकेंद्रित्र, और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण उपकरणों के उपयोग के लिए एरिक टी. Boder (टेनेसी Univ.); लेखकों स्फेरोप्लास्ट को विखंडन खमीर परिवर्तित करने के लिए प्रोटोकॉल के लिए कैरोलीन Leplante (. येल यूनिवर्सिटी) धन्यवाद और के लिए केंद्र अपने अल्ट्रा अपकेंद्रित्र के उपयोग के लिए पर्यावरण जैव प्रौद्योगिकी (विश्वविद्यालय टेनेसी), खमीर एंटीबॉडी के लिए गुंठर Daum (ग्राज़ विश्वविद्यालय प्रौद्योगिकी, ऑस्ट्रिया की.), तकनीकी सहायता के लिए प्रसूति और स्त्री रोग (विश्वविद्यालय टेनेसी मेडिकल सेंटर) विभाग के कर्मियों .
PROTOCOL #1: | |||
1.Growing yeast cells and converting to spheroplasts | |||
Edinburgh Minimal Media (EMM) | Sunrise Science Products | 2005 | |
Yeast extract with 5 supplements (YE5S) | Sunrise Science Products | 2011 | YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD. |
YPD powder | Sunrise Science Products | 1875 | For S. cerevisiae |
Sorbitol | Fisher Scientific | BP439 | |
Yeast Lytic Enzyme | MP Biomedicals | 215352610 | |
Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum | Sigma-Aldrich | L1412 | |
Zymolayse-20T | Sunrise Science Products | N0766391 | For S. cerevisiae |
BODIPY 493/503 | Invitrogen | D-3922 | |
Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 137115AM | |
1 liter glass bottle | |||
250 ml flask | |||
2.8 liter flasks | |||
2. Yeast lipid droplet isolation | |||
Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
Ficoll 400 | Fisher Scientific | BP525 | |
12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
Dounce Homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
Ultracentrifuge Tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane | SpectrumLabs | 132680 | |
Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor | Thermo-Scientific | 75003698 | |
Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
PROTOCOL #2 | |||
1. Placental villous cells isolation | |||
Disposable underpads | Fisher Scientific | 23666062 | |
Autoclavable pan (container), 3L | Fisher Scientific | 1336110 | |
Fine scissors, sharp-sharp, straight | Fine science tools | 1406011 | |
London Forceps | Fine science tools | 1108002 | |
Dumont #7b Forceps | Fine science tools | 1127020 | |
Razor blades | Fisher Scientific | S65921 | |
Screen cup for CD-1 | Fisher Scientific | S1145 | |
40 mesh screen | Fisher Scientific | S0770 | |
Fisherbrand cell stainers 100μm | Fisher Scientific | 22363549 | |
150 mm Petri Dishes | Fisher Scientific | NC9054771 | |
NaCl | Fisher Scientific | S642 | |
KCl | Fisher Scientific | P333 | |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P386 | |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374 | |
D-glucose | Fisher Scientific | D16 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
2.5% trypsin 10x | Invitrogen | 15090046 | |
DNase I grade II, from bovine pancreas | Roche Applied Science | 10104159001 | |
Sodium bicarbonate solution | Sigma-aldrich | S8761 | |
500 ml Erlenmeyer flasks | |||
250 ml beakers | |||
15 ml centrifuge tubes | |||
10 ml serological pipettes | |||
50 ml centrifuge tubes | |||
DMEM | Invitrogen | 11965084 | |
2. Lipid droplets isolation from villous placental cells | |||
Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153 | |
EDTA | Fisher Scientific | BP120 | |
D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220 | |
Sodium Carbonate | Fisher Scientific | BP357 | |
EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics | 11873580001 | irritant |
Dounce homogenizer | Sigma-Aldrich | D9938 | |
Ultracentrifuge tubes 25x89mm (for SW28) | Beckman-Coulter | 355642 | |
Ultra-Clear centrifuge tubes 14x89mm (for SW41) | Beckman-Coulter | 344059 | |
Disposable borosilicate glass pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820C | |
Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Biological safety hood | Thermo-Scientific | ||
Waterbath | Fisher Scientific | ||
Temperature-controlled shaker | New Brunswick Scientific | C25KC | |
Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge | Thermo-Scientific | 75004521 | |
Swinging Bucket Centrifuge Rotor | Thermo-Scientific | 75003607 | |
Ultracentrifuge LB-M | Beckman-Coulter | ||
SW28 Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 342204 | |
SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman-Coulter | 331336 | |
Western blot | |||
IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR | 926-68071 | dilution 1:15000 |
IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | dilution 1:5000 |
NuPAGE® Novex® 12% Bis-Tris gels | Invitrogen | NP0341 | |
primary antibodies for PROTOCOL #1 | |||
Erg6p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
Dpm1p | Abcam | ab113686 | 4 μg/ml |
Por1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:5000 |
Pma1p | gift from Dr. G. Daum | Graz University of Technology, Austria | dilution 1:10000 |
Vma1p (anti-ATP6V1A) | Abcam | ab113745 | 0.5 μg/ml |
primary antibodies for PROTOCOL #2 | |||
perilipin 2 (anti-ADFP) | Abcam | ab52355 | 2 μg/ml |
calnexin | Cell Signaling technology | 2679 | dilution 1:1000 |
GM130 | Biorbyt | orb40533 | dilution 1:25 |
COX IV | Cell Signaling technology | 4850 | dilution 1:1000 |
MEK1 | Biorbyt | orb38775 | dilution 1:50 |